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研究背景及目的:研究蛋白质与蛋白质的相互作用对于了解蛋白质的生理功能以及调控生物过程的作用机制有非常重要的作用。免疫共沉淀结合质谱的分析技术是高通量研究蛋白与蛋白相互作用的主要方法之一。然而传统的免疫共沉淀实验,在纯化相互作用蛋白时使用全细胞裂解液,打破了各种生物膜的界限,产生了一些人为引入的蛋白与蛋白之间的相互作用,因此在研究蛋白质的相互作用时容易出现假阳性结果。补体1q结合蛋白C(the complement component 1,q subcomponent binding protein,C1QBP)也叫作p32、HABP1,是一种与补体成分C1q结合并与g C1q受体相结合的酸性蛋白。它是一种多功能蛋白质,参与免疫、代谢、肿瘤转移等多种生物过程,广泛的分布在细胞的各个组分中,如细胞质、细胞核等,尤其在线粒体中丰度较高。虽然,C1QBP在线粒体中丰度最高,但是C1QBP在线粒体中的的作用机制目前还不清楚。线粒体是细胞中十分重要的亚细胞器结构,是细胞进行呼吸作用产生能量的重要场所。由于组织和细胞中线粒体的大小和数量随细胞类型的不同而不同,因此提纯线粒体时需要根据实验对象的不同选择并优化提纯方法。其中,蔗糖离心的方法是比较传统并且被广泛应用的分离线粒体的方法之一。本研究,主要结合线粒体提取、免疫共沉淀、质谱分析等方法研究线粒体中C1QBP相互作用的蛋白质组,从而对C1QBP在线粒体中的功能和作用机制进行探讨。材料与方法:1)通过改进提取线粒体的方法,得到相对纯净的线粒体,并对线粒体中的蛋白及细胞质中的蛋白含量进行对比。2)通过改进免疫共沉淀的实验方法来得到线粒体中与C1QBP相互作用的蛋白,并进行液质联用质谱鉴定。3)通过利用C1QBP抗体对C1QBP进行免疫共沉淀实验以及利用二氢硫辛酰转乙酰基酶(Dihydrolipoyllysine-residue acetyltransferase,DLAT)抗体对DLAT进行免疫共沉淀实验来验证C1QBP与DLAT真实存在相互作用关系,并用免疫荧光实验进行共定位验证。4)通过升高或者降低C1QBP的表达,研究C1QBP对DLAT以及丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)活性的影响。结果:1)通过改进线粒体分离提纯的方法,得到了纯净的线粒体,并且通过对比发现线粒体中蛋白的总量大约是细胞质蛋白的13%。2)通过改进免疫共沉淀实验技术,提高了免疫共沉淀的效果,并降低了其中的非特异性吸附蛋白的含量。3)通过质谱鉴定到在线粒体中与C1QBP相互作用的蛋白DLAT。4)验证C1QBP与DLAT确实存在相互作用。5)当C1QBP表达量升高时,PDH的活性升高;同样,当C1QBP降表达以后,PDH的活性降低,说明C1QBP通过与DLAT相互作用调控PDH的活性。结论:通过分离线粒体,在线粒体中进行免疫共沉淀,并且与质谱技术相结合,首次发现了C1QBP在线粒体中的相互作用的蛋白质DLAT,并且发现C1QBP通过与DLAT相互作用调控PDH的活性,该研究提示了C1QBP在线粒体中的一种新的作用机制。这种将亚细胞器分离与免疫共沉淀技术和质谱技术相结合的方法为研究其它蛋白在不同细胞区域中的相互作用蛋白提供了一种新思路。