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目的:构建人结核杆菌Hsp65和Ag85B膜锚定共表达质粒pIRES-MTHsp65 -Ag85B,并检测其在体外的表达。方法:利用PCR技术分别从质粒pBCG-SP-Hsp65和结核杆菌H37Rv的基因组中扩增出Hsp65和Ag85B基因。并将其克隆到真核表达质粒pVAC中,分别获得重组质粒pVAC-Hsp65、pVAC-Ag85B。然后分别以pVAC-Hsp65、pVAC-Ag85B质粒为模板,采用PCR技术扩增出5′端含编码人白介素2(IL-2)23个氨基酸的信号序列与3′端含编码人胎盘碱性磷酸酶(PLAP)COOH-末端32个氨基酸的膜锚定序列的Hsp65、Ag85B修饰基因。并将这两个修饰基因先后定向克隆到真核表达载体pIRES上获得共表达质粒pIRES-MTHsp65-Ag85B。将重组质粒转染Hela细胞,通过RT-PCR的方法检测转染细胞中Hsp65和Ag85B mRNA的表达。结果:经过PCR、酶切鉴定和测序证实所克隆的Hsp65、Ag85B基因与报道结果完全一致,重组真核表达质粒pIRES-MTHsp65-Ag85B构建成功,并且转染Hela细胞总RNA中结核杆菌Hsp65和Ag85B mRNA为阳性。结论:成功构建了人结核杆菌Hsp65和Ag85B膜锚定双表达质粒pIRES-MTHsp65-Ag85B,该质粒转染人子宫颈癌Hela细胞后获得表达,为进一步对其免疫原性和抗感染效应的研究奠定了基础。目的构建含日本血吸虫相对分子质量为26 000的抗原(Sj26GST)基因的膜锚定表达DNA疫苗,观察其免疫BALB/c小鼠后的免疫应答效应。方法用RT-PCR法,以血吸虫成虫RNA为模板,扩增获得Sj26的全长基因。利用重组PCR技术,在Sj26基因的5′端加上编码IL-2的信号肽核苷酸序列,3′端加上编码胎盘碱性磷酸酶的膜锚定序列,然后将其克隆入pIRES载体中,构建一个膜锚定型真核表达质粒pIRES-Sj26。将重组质粒转染HeLa细胞,通过RT-PCR及间接免疫荧光技术检测目的基因的表达。用构建的pIRES-Sj26疫苗肌肉注射免疫BALB/c小鼠后,用ELISA试剂盒检测小鼠血清中的总IgG抗体浓度和脾淋巴细胞培养上清的干扰素γ(INF-γ)含量,以淋巴细胞刺激指数(SI)反应淋巴细胞增殖能力,用流式细胞术检测脾细胞CD4/CD8亚群。结果经过酶切鉴定、PCR及测序证实重组质粒pIRES-Sj26构建成功,经转染HeLa细胞及免疫荧光检测证明质粒pIRES-Sj26能在体外进行表达。免疫小鼠后检测结果表明pIRES-Sj26组的血清总IgG抗体浓度、INF-γ的含量明显高于对照组和空载体组(P<0.01);其脾SI高于对照组和空载体组(P<0.05);CD8+细胞百分比高于对照组和空载体组(P<0.05), CD4+细胞百分比没有显著变化(P>0.05)。结论成功构建日本血吸虫膜锚定表达DNA疫苗pIRES-Sj26,表达的Sj26蛋白大部分锚定在细胞膜上。pIRES-Sj26疫苗能增强BALB/c小鼠的免疫应答反应。