文昌鱼miR-183和miR-216基因簇的表达模式和保守性研究

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MicroRNAs(miRNAs)是近年来新发现的一种长度约为22个核苷酸的高度保守的内源性非编码小RNA。它们在后生动物基因组中普遍存在,是生物基因调控网络的重要组成。越来越多的证据表明,miRNAs在动物发育和人类疾病发生中发挥重要作用。它们广泛参与胚胎早期发育、器官形成、细胞增殖分化、细胞凋亡等生理过程,并对肿瘤发生有一定影响。   miRNA基因簇(miRNA clusters)是指miRNA基因在染色体上紧密分布的现象。miRNA基因簇在动物中是较常见的现象,其在细胞基因表达调控的网络系统中发挥重要作用,比单个miRNA的调控模式更加复杂,功能作用更加高效。但相对于单个miRNA,miRNA基因簇在表达、功能和进化方面的研究仍处于起步阶段。因此,有必要对现有的miRNA基因簇进行深入研究。同时,对一些高度保守的基因簇进行研究,将有助于我们理解miRNA的起源与发生以及相关的动物类群的演化和发展。   miR-183基因簇是一个在后口动物中高度保守的基因簇,在脊椎动物中编码miR-182、miR-96和miR-183这3个miRNAs,文昌鱼中则只有MiR-96和miR-183。miR-216基因簇,包含miR-216和miR-217两个miRNAs,是脊索动物特有的基因簇,不存在于无脊椎动物。本论文以经典模式动物--文昌鱼为研究对象,鉴定获得miR-183基因簇和miR-216基因簇各miRNAs基因,阐明这些miRNAs的组织分布及在胚胎中的表达规律,与其他生物的表达谱进行比较研究,结合前期靶基因的研究结果,以此推测其可能的功能以及在脊椎动物起源和演化中的意义。   本研究从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri tsingtauense)中鉴定获得了miR-183基因簇和miR-216基因簇,并对其在组织和胚胎中的时空表达模式及保守性进行了分析研究。   首先,根据佛罗里达文昌鱼miR-183基因簇和miR-216基因簇各基因家族成熟序列及前体序列设计引物,鉴定获得了青岛文昌鱼miR-183基因簇和miR-216基因簇各成员相应序列。通过比较分析,miR-183基因簇和miR-216基因簇都保守存在于后口动物中。   其次,应用实时定量PCR技术对miR-183基因簇和miR-216基因簇各家族成员在文昌鱼成体各组织中的表达情况进行了研究。结果表明,miR-183基因簇miRNAs在文昌鱼背神经管中表达量最高,在肝盲囊和脊索中的表达量较弱,在剩余其他组织中的表达量则较低;miR-216基因簇miRNAs在鳃中的表达量最高,肝盲囊中表达量次之,在剩余其他组织中的表达量很低。   最后,应用原位杂交技术对miR-183基因簇在组织和胚胎中的表达进行了研究。整体胚胎原位杂交结果显示,miR-183基因簇miRNAs在早期胚胎及一天幼虫中均没有表达,在两天幼虫的背神经管中明显表达。组织切片原位杂交结果则显示,miR-183基因簇在背神经管、肝盲囊和鳃中表达。   根据上述结果我们可以得出以下结论:miR-183基因簇和miR-216基因簇均表现出组织特异性表达,前者主要在背神经管中表达,后者主要在鳃和肝盲囊中表达;miR-183基因簇参与文昌鱼感觉神经器官的发育和功能,miR-216基因簇则可能与脊椎动物胰脏的起源有关。
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