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梁山慈竹是生产竹浆的优良纤维原料,但在竹浆生产过程中为了脱去竹木质素需加入大量的强酸强碱等化工原料,造成成本增加和环境污染。通过生物技术手段培育木质素含量低的竹种,具有巨大的经济效益和环境效益。竹类遗传转化的关键在于再生体系建立,而梁山慈竹等大型丛生竹的组织培养和植株再生一直是一大难点。本研究以梁山慈竹种胚和无菌苗不同部位为外植体,对梁山慈竹组织培养和再生体系进行了研究,并对愈伤组织类型及器官发生方式进行了分析;同时构建了慈竹木质素合成关键酶基因4CL的RNA干涉载体,并通过农杆菌介导法转化模式植物烟草和梁山慈竹愈伤组织。
组织培养结果表明,MS诱导效果优于WPM,MS2培养基更有利于愈伤组织的发生。种胚接种3天后开始膨大,进入愈伤组织诱导启动期;15天左右进入分裂期;30天后进入分化期,形成疏松易碎、增殖能力强的颗粒状愈伤组织,发生率高达96%。梁山慈竹愈伤组织有多种器官发生形式,不同发生形式的再生小植株的分株性能存在较大差异。在MS2上,以梁山慈竹无菌苗不同部位为外植体也能诱导出愈伤组织,并形成再生植株,嫩芽和幼嫩带节茎段诱导效果较好。
对获得的PCR阳性转基因烟草再生植株进行了烟草内源4CL1基因的半定量RT-PCR、组织化学染色、木质素含量和4CL酶活性分析。结果表明,多数转基因植株的内源4CL1基因表达量降低,转基因烟草植株的Wiesner染色比对照植株浅,木质素含量和4CL酶活性均有不同程度降低。茎部和叶部木质素含量的降低范围分别为7.6%~28.3%、2.9%~20.1%;4CL酶活性的降低范围分别为9%~38.5%、1.3%~39.9%。
采用农杆菌介导法侵染梁山慈竹愈伤组织,筛选一个月后,获得了抗性愈伤组织。PCR检测初步证明RNAi载体己导入梁山慈竹抗性愈伤组织基因组中,为获得木质素含量降低的梁山慈竹转基因植株,纸浆用竹改良和竹功能基因组学研究奠定基础。