[目的]　　通过使用Jagged-1组蛋白活化Notch信号通路及DAPT(γ-分泌酶抑制剂)抑制Notch信号通路，研究不同条件下该通路对小鼠胚胎干细胞分化为造血干/祖细胞中的影响，进而探讨Notch信号通路在小鼠胚胎干细胞分化中的作用。　　[方法]　　1.原代体外培养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)，作为胚体干细胞的饲养层　　无菌超净台内取出孕12.5d胚胎，去除头尾、四肢及内脏，将躯干组织剪碎，消化法获得细胞悬液，铺皿后体外培养，隔天换液，2-3d消化法传代培养。　　取第二到第四代细胞经丝裂霉素C处理作为饲养层。　　2.小鼠胚胎干细胞体外增殖　　复苏购买的小鼠胚胎干细胞在经丝裂霉素C处理好的饲养层上，加含LIF的ESCs培养基，每天或隔天换液，3-4d消化传代培养。　　3.小鼠胚胎干细胞体外诱导分化　　3.1拟胚体形成　　将诱导生长的拟胚体经胰酶-EDTA消化后，吹打制成单细胞悬液，差时贴壁法分离去除饲养层细胞，在无饲养层无LIF条件下培养4d，可形成球形拟胚体。　　3.2按计划分5组加药处理培养10天。　　①EB组，②Control组，③Jagged-1组，④DAPT组，⑤Jagged-1-DAPT组。　　其中EB组即为拟胚体细胞冻存10天后复苏组;Control组为无饲养层无LIF培养基条件下培养拟胚体细胞，处于自然分化状态;其余各组为加入活化剂或（和）抑制剂并在无饲养层无LIF条件下培养的拟胚体细胞(Jagged-1100ng/ml，DAPT10nmol/ml)，加药后培养10天，属于调控分化状态。　　4.流式细胞术检测小鼠造血干/祖细胞　　收集诱导分化培养10d的细胞，流式细胞术检测小鼠胚胎干细胞特异性表型CD31，SSEA1及造血干/祖细胞特异性表型CD117，CD34，Sca1。　　5.RT-PCR检测相关基因表达　　抽提上述诱导10d各组细胞的总RNA，RT-PCR法检测Notch信号通路基因Notch1，Notch2，Notch4，Hes1;小鼠胚胎干细胞表型基因SSEA1，Oct4;及造血干/祖细胞表型基因Sca1，H2k，c-kit。　　6.Western-Blot检测Nocth1蛋白表达　　提取上述诱导10d的各组细胞的总蛋白，采用Western-Blot检测Nocth1的表达量。　　[结果]　　1.加入Jagged-1组蛋白和（或）DAPT改变了Notch信号通路基因及蛋白的表达量。　　1.1 Notch信号通路相关基因Notch1，Notch2，Notch4 mRNA表达量变化　　Jagged-1组Notch1，Notch2，Notch4 mRNA表达量较Control组明显升高，差异均具有统计学意义(P＜0.05); DAPT组及Jagged-1-DAPT组之Notch1、Notch4 mRNA表达量较Control组降低，差异均具有统计学意义（P＜0.05），提示Jagged-1组蛋白激活了Notch信号通路，DAPT抑制Notch信号通路。　　1.2 Notch通路下游靶基因Hes-1上调　　Jagged-1组Hes1表达较Control组及DAPT组、Jagged-1-DAPT组明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05）;但Control组比DAPT组、Jagged-1-DAPT组表达量增高，差异无统计学意义（P＞0.05）;　　1.3 Western Blot检测Notch1蛋白表达量　　Jagged-1组与Control组相比Notch1蛋白表达量明显增加，且差异具有统计学意义(P＜0.05);但DAPT组、Jagged-1-DAPT组与Control组之间的表达差异不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）。结合PCR基因检测结果推断，Jagged-1组蛋白激活了Notch信号通路，DAPT抑制Notch信号通路，但分化后的细胞Notch通路作用能力减弱，与DAPT的作用结果相类似。　　2.使用DAPT增强了胚胎干细胞向造血干/祖细胞的分化效应，而使用 Jagged-1组蛋白削弱了胚胎干细胞向造血干细胞/祖细胞的分化效应。　　2.1流式细胞术鉴定胚胎干细胞及造血干/祖细胞　　(1) DAPT组及Jagged-1-DAPT组分化的造血干/祖细胞数较EB组、Control组及Jagged-1组明显增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，而DAPT组与Jagged-1-DAPT组比较差异无统计学意义（P＞0.05），提示阻断该通路能ESCs向造血干/祖细胞分化;　　(2) Jagged-1组细胞胚胎干细胞数较Control组、DAPT组及Jagged-1-DAPT组明显增多，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而较EB组的干细胞稍减少，但差异均无统计学意义（P＞0.05），DAPT组与Jagged-1-DAPT组之间小鼠胚胎干细胞数相比较无明显差异，提示激活Notch信号通路能抑制干细胞的分化。　　2.2 RT-PCR检测相关基因　　(1)检测干细胞相关表型基因SSEA1，Oct4，c-Kit，H-2k和Sca1表达量变化如下:　　①与ESCs组相比，除Jagged-1组SSEA1及Oct4mRNA表达量外无明显降低，其余各实验组的SSEA1（P＜0.01）及Oct4(P＜0.05)mRNA表达量明显降低，提示存在ESCs分化，而Jagged-1组蛋白通过激活Notch通路抑制ESCs的分化;　　②检测造血干/祖细胞基因特异性基因c-Kit, H-2k，各实验组均可测出，表明各实验组均存在已分化的造血干/祖细胞。DAPT组及Jagged-1-DAPT组表达量较其余各组明显增多，差异均具有统计学意义(P＜0.05);而Sca1表达量较Control组稍低，但差异不具有统计学意义(P＞0.05); Jagged-1组较EB组表达量差异不明显，不具统计学意义（P＞0.05），表明DAPT促进小鼠造血干/祖细胞表型基因c-Kit，H-2k，Sca1的表达，而Jagged-1组蛋白抑制基因的表达，进而推断Notch通路抑制胚胎干细胞分化向造血干细胞/祖细胞分化。　　(2) Notch信号通路相关基因Notch1，Notch2，Notch4表达量变化下:　　①与ESCs组细胞相比，Jagged-1-DAPT组、DAPT组及Control组的Notch1，2，4的mRNA的表达量均有降低，考虑为胚胎干细胞分化后Notch1，2，4基因可能受到抑制;DAPT组及Jagged-1-DAPT组之Notch1、Notch4表达量较Control组降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，表明添加通路阻断剂DAPT促进胚胎干细胞分化;　　②而Jagged-1组虽Notch1，Notch2，Notch43个受体表达量均有下降，但与ESCs组相比较差异不具有统计学意义(P＞0.05)，提示激活Notch通路能抑制胚胎干细胞分化，进而推断Notch通路抑制胚胎干细胞分化。　　2.3 Western Blot检测Notch1蛋白表达量　　免疫印迹实验检测到除Jagged-1组外，各实验组细胞Notch1蛋白表达量均较胚胎干细胞明显减少，差异具有统计学意义(P＜0.05);Jagged-1组与胚胎干细胞相比虽有所下降，但差异不具有统计学意义(P＞0.05);说明分化后Notch通路中Notch1蛋白表达量降低，同时Jagged-1组蛋白激活Notch通路，维持Notch1蛋白较高表达量，进而推断激活Notch通路能抑制干细胞的分化。　　[结论]　　1.Jagged-1组蛋白可通过活化Notch信号通路抑制胚胎干细胞向造血干/祖细胞的分化;DAPT可通过抑制Notch信号通路促进胚胎干细胞向造血干/祖细胞的分化;进而推断Notch信号通路在调控ESCs分化为造血干/祖细胞中起重要作用。