酵母双杂交筛选与文昌鱼BMP作用的蛋白及对蛋白酶体Y亚基的研究

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  本文以文昌鱼BMP2/4成熟肽为诱饵蛋白,应用MatchmakerTMGAL4Two-HybridSystem3技术成功筛选了文昌鱼神经胚cDNA文库,找出了与之相互作用的蛋白。通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得了60个已知蛋白的序列,包括发育相关蛋白、免疫相关蛋白、信号转导相关蛋白、代谢相关蛋白、蛋白合成与运输相关蛋白,及28个未知蛋白。文昌鱼神经胚中与BMP蛋白相互作用蛋白的成功筛选,为深入研究BMP在文昌鱼发育过程中的作用机理提供了线索。   在本次的酵母双杂交筛选中,我们获得多个与泛素-蛋白酶体途径相关的蛋白,我们再次将这些pGADT7-preys与pGBDT7-BMP/pGBDT7共转酵母菌株AH109进行酵母双杂交实验,发现它们在酵母体内都能与BMP直接相互作用,为BMP的酵母双杂交阳性克隆。以蛋白酶体仅有的三个蛋白水解酶活性亚基X/PSMB5、Y/PSMB6、Z/PSMB7的ORF构建酵母表达载体pGADT7-X/Y/Z,再次通过酵母双杂交实验发现X/PSMB5与BMP没有相互作用、Y/PSMB6与BMP有强相互作用、Z/PSMB7与BMP有弱相互作用。   以文昌鱼Y/PSMB6cDNA中的特异序列为引物,不同发育阶段和不同组织部位(消化道、鳃、精巢、卵巢、脊索、肌肉)的总cDNA一链为模板,做RT-PCR反应检测Y/PSMB6的转录模式。RT-PCR结果显示Y/PSMB6在文昌鱼的不同发育阶段以及不同组织中都有表达。为探究Y/PSMB6基因在文昌鱼基因组中的存在方式,对文昌鱼基因组进行了Southernblot。实验结果证明Y/PSMB6在文昌鱼基因组中以单拷贝的形式存在。通过NJ系统进化树分析,发现文昌鱼的Y/PSMB6在进化上与蛋白酶体组成型亚基Y更为接近。因此,文昌鱼的Y/PSMB6很可能只行使看家基因的功能。      
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