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通过SDS-PAGE,Protein blotting,PCR扩增和原核表达,在二倍体伪鹅观草(Pseudoroegneria stipifolia,l(o)ve,StSt,2n=14)中鉴定和分离了一个新型HMW-GS基因,命名为Glu-1St1。对其结构特征及系统进化研究发现,该基因具有两个显著的特征,一个是分子量明显偏小,DNA编码区全长1227bp(包括两个串联终止密码子),编码407个氨基酸,其重复区结构相对比较简单。另一个是它的N-末端序列与典型的y-亚基聚为一类,而C-末端序列与典型的x-亚基聚为一类,其整个编码区序列倾向于与y-亚基聚为一类,而启动子与x-亚基聚为一类,说明它不是典型的x-或y-型HMW-GS基因。通过Southern杂交只检测到了一条明显的杂交带,说明其拷贝数可能只有一个,加上其系统进化特征类似于大麦的D-hordein基因,推测Glu-1St1可能是一个原始类型的MW-GS基因。
经过MALDI-TOF-MS分析证实了通过分离的基因序列推导的氨基酸序列与种子胚乳中表达的亚基氨基酸序列一致,证明分离的基因就是胚乳表达的HMW-GS的编码基因,同时还证明Glu-1St1蛋白不存在翻译后的修饰。
通过HMW-GS基因的分化年代估算,Glu-1St1基因与普通小麦(A、B、D基因组)中的直向同源基因的分化时间为8.2±1.1百万年以前(MYA),与黑麦(R基因组)中的直向同源基因分化时间为8.8±1.2 MYA,与大麦(H基因组)中的直向同源基因分化时间为9.4±1.2 MYA。A,B和D三个基因组中的直向同源基因之间的分化时间为5.6±0.9 MYA,小麦与大麦和黑麦的直向同源基因之间的分化时间分别为13.2±1.3 MYA和6.4±1.0 MYA。说明St基因组与普通小麦基因组的分化时间早于普通小麦3个基因组之间的分化时间,也早于黑麦与小麦的分化时间,但比大麦与小麦的分化时间要晚。
从二倍体针茅叶偃麦草(Et.stipifolia,StSt)以及含有St基因组的多倍体种阿拉善鹅观草(R.alashanica,StStYY)、吉林鹅观草(R.nakaii,StStYY)和中间偃麦草(Et.intermedia,EeEeEbEbStSt)中克隆了5个小分子量HMW-GS基因,都具有完整阅读框,但通过SDS-PAGE发现在阿拉善鹅观草和吉林鹅观草中没有相应的蛋白表达条带。这些基因编码区长度都在1200bp左右。说明分子量小的HMW-GS在很多小麦近缘种属中都存在。在这些分子量小的HMW-GS基因中,中间重复区都比较短,并且存在半胱氨酸的多态性。来源于针茅叶偃麦草的Glu-1St2和Glu-1St3以及阿拉善鹅观草的Glu-1Ray1的系统进化特征与伪鹅观草的Glu-1St1类似,都属于中间类型。而来源于吉林鹅观草的Glu-1Rny1和中间偃麦草的Glu-1Aiy3两个HMW-GS基因已经分化成了典型的y-型HMW-GS基因。
为了研究通过HMW-GS基因定点突变改良小麦品质的可行性和HMW-GS中半胱氨酸残基的品质效应,将普通小麦的HMW-GS基因1Dx2编码区的第353位碱基C替换成G,使其编码蛋白亚基的中间重复区第118位的丝氨酸残基(S)变成半胱氨酸残基(C),从而使之在一级结构上类似于优质亚基基因1Dx5。突变基因命名为1mDx2。
利用1Bx14启动子构建了pCAMBIA1300+P1Bx14+1mDx2+CaMV35STerminator转化载体,该载体上带有抗除草剂Bar基因。通过花粉管通道和基因枪转化普通小麦兰考52-24(HMW-GS组成为1Ax1,1Bx7+1By9,1Dx5+1Dy10),都得到了目的基因表达的转基因植株。通过花粉管通道转化在T1代得到了1株表达1mDx2亚基的转基因植株,其HMW-GS组成为1Ax1,1Bx7+1By9,1Dx2+1Dx5+1Dy10。在该转基因植株的T2代,1Ax1、1Bx7+1By9和1Dy10亚基都表达,但Glu-1D位点的x-型亚基表达情况出现了3种类型:第一种是1mDx2基因表达,同时1Dx5基因沉默;第二种是1mDx2和1Dx5基因同时表达;第三种是1Dx5表达,1mDx2基因不表达。3种情况的分离比符合1∶2∶1。如果只考虑目的基因1mDx2的表达情况,则表达的与不表达的分离比符合3∶1,即符合一对显性基因控制的孟德尔遗传规律,说明1mDx2基因是单拷贝插入的。通过1Dx5基因特异性的分子标记(基因内标记)检测,在1mDx2基因表达同时1Dx5基因沉默的T2代转基因植株中没有检测到1Dx5基因的标记,由此推测可能是1mDx2基因通过同源重组取代了1Dx5基因。通过基因枪转化,结合Bar基因的PCR筛选,在T0代获得了11株阳性植株。通过SDS-PAGE检测,在T1代筛选到两株表达目的亚基1mDx2的转基因植株。其中一株与对照相比,只增加了转基因表达的亚基。另一株共表达了7个HMW-GS,不仅表达了受体兰考52-24的5个亚基和1mDx2亚基,还表达了一个电泳迁移率类似于1By8的新亚基。对两种转基因方法获得的转基因植株的表现型进行比较,发现通过花粉管通道转化的植株T1代变异较小,而通过基因枪转化的植株T1代变异较大。