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卵母细胞冷冻在体外胚胎生产技术的研究中尤为突显。但在其冷冻过程中,易受到一系列的损伤。随着分子生物技术的快速发展,研究人员对卵母细胞冷冻损伤的研究逐步转向对其分子机制的探讨,其中跨膜蛋白的变化有可能引起精卵结合和融合异常。CD9是目前鉴定的唯一精卵融合必须的卵子蛋白,并且有相关报道CD81也参与精卵融合。胞间CD81和CD9互作时形成一个复合体,该复合体很可能在精卵互作时起作用。然而,它们在膜融合中的作用仍不清楚。本研究首次采用免疫荧光染色技术检测了不同发育期绵羊卵母细胞冻融前后细胞骨架的变化,CD81在绵羊卵巢组织、睾丸和附睾组织、卵母细胞及精子上的分布；采用实时荧光定量PCR技术,检测了CD81在不同发育期冻融前后的绵羊卵母细胞中：mRNA水平的表达量,并比较分析了不同发育阶段CD81基因mRNA水平的表达差异；利用IVF技术,检测了抗CD81抗体对绵羊精卵结合的影响,及冻融GV期和M Ⅱ期卵母细胞对IVF的影响。本研究得到如下几点结果：1.冷冻对卵母细胞器及细胞骨架的影响结果表明,冷冻后GV期和M Ⅱ期卵母细胞的形态正常率显著低于冷冻前,微丝、微管及核受到不同程度的损伤。说明冷冻保存损伤其结构和细胞骨架,可能影响卵母细胞的后期发育；2.CD81在绵羊卵巢组织、卵母细胞、睾丸和附睾组织及精子上的表达检测结果显示：(1)CD81表达于初级、次级和三级卵泡的卵泡细胞上,并且在卵泡发育成熟时,其在卵丘细胞、颗粒细胞、基膜、内膜细胞和外膜细胞上均表达；(2)CD81在成熟前后卵母细胞上均有表达,但GV期卵母细胞上CD81主要在卵母细胞膜上表达,而MⅡ期卵母细胞上CD81的表达主要在卵母细胞膜和透明带上,并且在透明带上的表达较GV期明显；(3)CD81在绵羊睾丸曲细精管上皮细胞上表达,靠近管腔基部信号更强。附睾头、体假复层纤毛柱状上皮细胞中高柱状纤毛上皮细胞和游离缘的纤毛中均检测到CD81阳性信号。附睾体、尾管腔中检测到CD81阳性信号,且附睾尾管腔内CD81阳性信号明显。CD81于附睾头、体、尾部的基细胞层表达,且在附睾体、尾的基细胞层强表达；(4)CD81强表达于精子的顶体部,其余部位均未检测到CD81蛋白荧光信号；3.CD81在不同发育阶段冷冻的卵母细胞中mRNA表达规律结果显示：新鲜MⅡ期卵母细胞中CD81 mRNA表达量显著高于冷冻MⅡ、新鲜GV和冷冻GV(P<0.01),冷冻M Ⅱ显著高于新鲜GV和冷冻GV(P<0.01),新鲜GV与冷冻GV差异不显著(P>0.05);4.抗CD81抗体和超低温冷冻对精卵结合和融合的影响。卵母细胞与CD81单克隆抗体共孵育处理后的试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组(4.2±0.8,30%)明显低于对照组(13±1.22,85%),差异均显著(P<0.01)。冻融后GV期卵母细胞对IVF的影响结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组(5.8±0.8,45%)明显低于对照组(13±1.22,85%),差异均显著(P<0.01)。冻融后M Ⅱ期卵母细胞经IVF后试验结果显示：每卵黏附精子数和精子穿透率分别为实验组(7.0±1.0,62%)明显低于对照组(13±1.22,85%),差异均显著(P<0.01)。并且,冻融后M Ⅱ期和GV期卵母细胞经IVF后每卵黏附精子数和精子穿透率差异显著(P<0.01)。