论文部分内容阅读
γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统中有效的抑制性神经递质，具有降血压、增进脑活力、营养神经细胞、保持神经安定、促进生长激素分泌和保肝利肾等作用，目前在医药和保健食品中已有广泛的应用。GABA制备方法主要有化学合成法和生物合成法两种，相比较而言生物合成法较安全，成本也低。谷氨酸脱羧酶(GAD)能专一催化L-谷氨酸脱羧生成γ-氨基丁酸和CO2，该酶广泛存在于原核和真核生物细胞中。
本文利用E.coli AS1.505GAD及工程菌DM201(pET32a-gadA/BL21)GAD制备γ-氨基丁酸，分别对大肠杆菌GAD和工程菌GAD的发酵工艺以及酶学性质进行了研究，并且对两种菌GAD酶学特征进行了比较研究。
通过对大肠杆菌GAD发酵工艺及转化条件的优化得到以下结论：最佳发酵条件为接种量体积分数8％，发酵温度37℃，发酵时间16h；转化所需要的最适条件为转化体系温度37℃，pH4.8，菌体浓度6g/L，吐温-800.15g/L，底物浓度50g/L。大肠杆菌GAD在最适转化条件下比酶活可以达到16010U。利用卡拉胶与明胶复合载体固定化大肠杆菌细胞，得出了在m(卡拉胶)：m(明胶)=3:2，ρ(混合胶)=12g/L，ρ(KCl)=60g/L，固定化时间3h，ρ(菌体)=80g/L的条件下大肠杆菌GAD酶活回收率较高；确定了固定化细胞转化所需要的最适条件为：温度37℃，pH4.8，ρ(底物)=40g/L。包埋1.0g湿菌体的固定化细胞可重复使用7次，把42g L-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸。利用大肠杆菌GAD将混合氨基酸料液中的L-谷氨酸完全转化为γ-氨基丁酸，解决了从废氨基酸料液中分离L-谷氨酸的难题，得到了附加值较高的γ-氨基丁酸。Berthelot显色法测得混合氨基酸转化液中γ-氨基丁酸含量为19.1g/L，氨基酸分析仪测得γ-氨基丁酸含量为18.5g/L，二者结果相近。由于Berthelot显色法具有快速，简便等优点，故在一些情况下可以代替氨基酸分析仪测定法。
通过对工程菌GAD发酵工艺及转化条件的优化得到以下结论：发酵过程中最适接种量体积分数为2％，IPTG最适诱导浓度为0.4mmol/L，最适诱导时间6h左右，最适诱导温度30℃；转化过程中最适转化温度为42℃，最适pH为4.0，最适底物浓度为80g/L，最适菌体浓度为15g/L。
对大肠杆菌与工程菌GAD酶学特征进行比较研究得到以下结论：不同温度下大肠杆菌GAD、工程菌GAD的动力学常数vm均为工程菌GAD>大肠杆菌GAD，Km值则是大肠杆菌GAD>工程菌GAD，温度越高，GAD的vm越高，大肠杆菌GAD对底物的亲和力在37℃下最大，工程菌GAD对底物的亲和力则是在47℃下最大；工程菌GAD对高温及低pH环境具有更好的耐受性；0.3g工程菌在最适转化条件下可将18gL-谷氨酸在29.5h内完全转化为GABA，同样重量的大肠杆菌在最适转化条件下可将14gL-谷氨酸完全转化为GABA，并且需要耗时55h，工程菌GAD的转化效率大大高于大肠杆菌GAD。