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目的构建水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂(LDTI)原核表达载体,将其转化入大肠杆菌[BL21(DE3)]中优化表达条件,以期获得重组类胰蛋白酶抑制剂的高效表达,并为进一步研究水蛭源性类胰蛋白酶抑制剂的生化特性,生物学功能及其对于肥大细胞影响和对过敏性疾病的潜在治疗作用奠定基础。方法1.基因克隆①LDTI基因扩增:以含目的基因片段的质粒为模板,运用PCR技术扩增出LDTI基因,通过1.4%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。②T克隆载体的构建:将上步所得DNA片段与pMD18-T载体连接,构建含目的片段的T载体克隆,转化入大肠杆菌JM109,扩大培养提取质粒,通过菌落PCR,以及限制性内切酶双酶切和基因测序进行质粒鉴定。③pET28a-LDTI载体的构建:对上述T载体进行双酶切,取目的片段与经过双酶切的pET28a片段连接,构建原核表达载体pET28a-LDTI重组质粒亚克隆,将其转化入大肠杆菌JM109,扩大培养,提取质粒,进行菌落PCR、限制性内切酶双酶切和基因测序鉴定。2.蛋白表达①pET28a-LDTI表达载体转化BL21(DE3)。②IPTG诱导pET28a-LDTI基因表达目的蛋白。经Tricine-SDS-PAGE电泳及抗6×His抗体鉴定融合蛋白。优化诱导表达的时间和IPTG的诱导浓度,诱导重组蛋白快速大量表达。结果1.琼脂糖凝胶电泳图像上在约140bp处可见一条亮带,表明成功扩增了目的基因片段。2.菌落PCR,双酶切以及基因测序结果显示利用基因克隆技术成功构建了T克隆载体。3.菌落PCR,双酶切以及基因测序结果显示利用基因克隆技术成功构建了pET28a-LDTI表达载体。4.pET28a-LDTI重组子可被IPTG诱导表达,并且可以高效表达LDTI,在Tricine-SDS-PAGE电泳图像上约6.8KD处表现为一条粗蛋白带。符合Western-blot鉴定结果。在温度为33℃,IPTG浓度为0.7mM,诱导1h后,所表达的目的蛋白量最大,约占菌体总蛋白的15%左右。结论成功构建LDTI原核表达载体并使其在原核系统中高效表达,为以后进一步研究LDTI蛋白的功能奠定了基础。