【摘 要】
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该实验根据B95-8细胞的基因组序列中LMP1,设计扩增LMP1羧基端的三个基因片段:①CCT:187-386位氨基酸.②CTAR23:267-386位氨基酸.③CTAR2:311-386位氨基酸.试图通过这样的设计
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该实验根据B95-8细胞的基因组序列中LMP1,设计扩增LMP1羧基端的三个基因片段:①CCT:187-386位氨基酸.②CTAR23:267-386位氨基酸.③CTAR2:311-386位氨基酸.试图通过这样的设计把与信号转导有关的LMP1羧基端的重要功能结构域表达出来.设计了三对引物,分别在上下游引入BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切位点,以B95-8细胞总RNA为模板进行RT-PCR,产物经提纯回收后与pGEM-T easy进行T-A连接,转化大肠杆菌JM109.挑取阳性克隆摇菌,提取质粒双酶切鉴定后送测序,扩增片段CCT长度为597bp,CTAR23长度为357bp,CTAR2长度为225bp,与B95-8来源的EBV基因组中LMP1比较后证实为目的基因片段.利用引物上的BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切位点,把三个片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-3上,然后转化大肠杆菌BL21.在摇菌温度为25℃,IPTG终浓度为0.2mM时,可溶性融合蛋白的表达量最高.用SDS-PAGE和Western blot融合蛋白进行分析,CCT融合蛋白约51KD,CTAR23融合蛋白约42KD,CTAR2融合蛋白约37KD,均能与LMP1单克隆抗体特异性结合,表明所表达蛋白质为目的蛋白质.用谷胱甘肽亲和层析柱Glutathione Sepharose 4B可以把融合蛋白纯化出来,再利用PGEX-6P-3载体上的Prescission Protease酶切位点用Prescission Protease把目的短片段酶切分离提纯.尽管很多学者认为,LMP1羧基端是其致瘤的主要效应子,并对此进行了一系列的缺失突变研究,但是,尚未获得LMP1与信号转导各效应子的直接联系,也未获得LMP1蛋白与其它蛋白之间的直接联系.该实验成功获得LMP1 CCT,CTAR23,CTAR2三个与信号转导密切相关的的纯化蛋白,为我们研究LMP1致瘤机制,进而开发拮抗LMP1蛋白作用的小分子短肽类药物奠定坚实的基础.
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