【摘 要】
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环鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP,c GAS）作为一种双链DNA感受器,能够通过识别双链DNA（ds DNA）,进而合成第二信使2’,3’-c GAMP,活化内质网（ER）上的STING蛋白（Stimulator of interferon genes）,通过STING-TBK1-IRF-3信号轴以激活I型干扰素（IFN-β）诱导的免疫应答。近年来,越来越多的研究发现,抑制干扰素
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环鸟苷-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP,c GAS）作为一种双链DNA感受器,能够通过识别双链DNA（ds DNA）,进而合成第二信使2’,3’-c GAMP,活化内质网（ER）上的STING蛋白（Stimulator of interferon genes）,通过STING-TBK1-IRF-3信号轴以激活I型干扰素（IFN-β）诱导的免疫应答。近年来,越来越多的研究发现,抑制干扰素以及干扰素刺激因子（ISGs）能够有效地减轻如Aicardi-Goutières综合征和系统性红斑狼疮等自身免疫性疾病引发的表型甚至具有完全的治疗作用。因此找到能够有效地抑制干扰素表达的关键靶基因及相关的小分子化合物十分重要。本课题组之前的研究发现小分子化合物Compound C可以通过调节c GAS-STING抑制IFN-β的表达,并可能应用到自身免疫性疾病的治疗中,但作用机制还有待进一步研究,尤其是相关靶基因还不明确。本论文首先针对Compound C进行了结构优化,合成了5种Compound C的类似物并开展进一步的功能机制研究。我们利用蛋白质印迹（Western blot）、q RT-PCR等方法测试了Compound C及其类似物对c GAS-STING通路及干扰素表达的调节作用。研究结果显示:（1）在Herring-Testis DNA（HTDNA）刺激的情况下,小分子化合物Compound C处理后细胞的IFN-β表达明显低于对照组细胞,但Poly（I:C）的刺激并不能产生类似的效果;（2）基于Compound C的化合物骨架研发并合成5种类似物（Compound 1、Compound 2、Compound 4、Compound 5和Compound 6）,并且逐一验证它们的有效性。其中Compound 4、Compound 5和Compound 6能有效地抑制HT-DNA诱导的IFN-β表达,而Compound 1和Compound 2则没有作用效果;（3）在TREX1基因敲除的细胞模型中验证Compound C及其类似物可以抑制因TREX1缺失引发的I型干扰素及干扰素刺激因子的高表达,这些研究表明Compound C及其类似物有用于治疗自身免疫性疾病的潜力。接着我们进行了相关机制的研究。通过RNA-seq二代测序结果发现,Compound C通过调节溶质载体家族10（钠/胆酸协同转运蛋白家族）,成员3（solute carrier family 10（sodium/bile acid cotransporter family）,member 3）-SLC10A3基因,影响干扰素免疫反应。SLC蛋白家族属于一类常见的溶质载体,它们主要参与调控细胞内或细胞间有机离子、短肽和胆固醇衍生物等信号分子的运输。家族成员之一的SLC19A1被报道与细胞间c GAMP的转运有关,进而可以影响IFN-β的表达。因此,我们对Compound C及其类似物与SLC10A3基因之间的关系进行验证。结果显示:（1）在Compound C处理后的多种细胞系中SLC10A3基因的m RNA和蛋白表达均显著降低,并且这种抑制作用表现出浓度依赖性;（2）Compound C、Compound 4、Compound 5和Compound 6均可以发挥对SLC10A3抑制作用的同时表现出通过c GAS-STING信号通路对ds DNA诱导的IFN-β表达的抑制作用。而Compound 1或Compound 2,它们对SLC10A3基因的表达没有任何影响,同时也不会抑制I型干扰素的表达;（3）SLC10A3基因的缺失可以显著的抑制HT-DNA诱导的IFN-β的表达,且这种抑制作用依赖于c GASSTING信号通路的转导。同时研究也发现SLC10A3基因缺失对ds RNA诱导的RNA免疫信号通路并没有显著的抑制作用。综合以上结果,我们认为SLC10A3基因与Compound C及其类似物和c GAS-STING信号通路之间存在一定的作用关系,Compound C可以通过调节SLC10A3基因影响干扰素免疫应答。接下来将通过深入了解SLC10A3基因功能及Compound C与SLC10A3基因之间的调控机制将有助于进一步的了解c GAS-STING信号通路的生物学作用,为日后将Compound C类似物研发成新的治疗自身免疫性疾病的小分子药物奠定坚实的基础。
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