论文部分内容阅读
酒精性肝病（Alcoholic liver disease,ALD）是由于长期大量饮酒引起的一系列酒精性慢性肝脏病变的总称。酒精性脂肪肝（Alcoholic fatty liver,AFL）是ALD的最早期阶段,其典型的特征为脂肪（主要为三酰甘油）大量蓄积在肝细胞内。AFL如不及时干预治疗,很可能会进一步发展为肝炎、肝纤维化、肝硬化甚至是肝细胞癌。腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase,AMPK）是真核生物进化中保守的一种Ser/Thr蛋白激酶,因其能够敏锐感知细胞中的能量变化并进行代谢调控,故常被喻为细胞“能量代谢开关”。众多研究证实,在脂肪肝中,AMPK活性常常被抑制,导致下游转录因子PPAR-α活性降低而SREBP1c活性增强,同时参与脂肪酸合成的限速酶ACC也因去磷酸化而被激活,最终导致肝脏中的脂肪酸合成增强而其氧化降解减弱,从而引起肝脂沉积。二甲双胍是一种广泛应用于2型糖尿病治疗的一线药物,其糖尿病治疗史已逾半个世纪。除了降血糖外,二甲双胍也被报道具有减肥、抗癌和抗衰老等诸多功效。大量研究表明,二甲双胍可通过改善肝脂代谢有效缓解非酒精性脂肪肝。其中,二甲双胍对AMPK介导的脂质代谢通路的激活是发挥其保肝作用的重要机制之一。然而,目前二甲双胍在AFL中的作用却鲜有报道。鉴于目前已知的AFL发病机制,我们推测二甲双胍可能通过改善肝脂代谢有效缓解AFL。接着,我们对AMPK上游的两条调节通路进行了检测以明确二甲双胍激活AMPK的上游调控机制。同时,我们也对二甲双胍长期施药的安全性进行了评估。实验目的:探究盐酸二甲双胍对AFL的影响及可能的作用机制并对盐酸二甲双胍在给药过程的安全性进行评估。实验方法:为验证上述假设,我们先后通过离体和在体实验探究盐酸二甲双胍对AFL的影响和作用机制。离体实验中,我们设置了对照组、模型组、给药组、LKB1干扰组和Ca MKK2干扰组。我们在AML12细胞系中用200 m M的无水乙醇诱导脂肪沉积模型,用2 m M的盐酸二甲双胍干预建立给药组,用LKB1和Ca MKK2的si RNA转染细胞建立干扰组。建模结束后,我们通过尼罗红染色检测各组细胞的脂肪蓄积情况,采用实时荧光定量PCR测定细胞内SREBP1c和PPAR-α的m RNA表达水平,利用试剂盒检测胞内TG（三酰甘油）含量,通过蛋白免疫印迹法检测LKB1、Ca MKK2、AMPK和ACC的蛋白表达情况。在体实验中,我们设置了对照组、模型组、给药组、干扰阴性对照组、LKB1干扰组和Ca MKK2干扰组。参照Gao-binge模型在C57BL/6小鼠体内建立AFL模型,同时通过经口灌胃法以200 mg/kg的剂量对小鼠进行盐酸二甲双胍干预得到给药组,通过尾静脉注射腺相关病毒包装的sh RNA建立相应的干扰组。建模结束后,我们收集小鼠的血清和肝脏,通过组织切片法和油红O染色及HE染色进行肝脏病理学检测,利用试剂盒检测血清的ALT（丙氨酸氨基转移酶）、AST（天冬氨酸氨基转移酶）、TG和TC（总胆固醇）含量,通过蛋白免疫印迹法检测肝脏中LKB1、Ca MKK2、AMPK和ACC的蛋白表达情况。最后,我们通过相关生化及病理检测对盐酸二甲双胍长期施药的安全性进行评估。实验结果:（1）离体实验:尼罗红染色结果显示,与对照组相比,AML12细胞经200 m M的无水乙醇刺激24小时后,细胞脂肪沉积显著增多,表明模型构建成功。同时,模型组TG含量和SREBP1c的m RNA水平显著上升而PPAR-α的m RNA水平显著下降。此外,与对照组相比,模型组中磷酸化的LKB1、AMPK和ACC蛋白水平均显著降低。然而,与模型组相比,盐酸二甲双胍给药后脂肪沉积明显改善,TG含量和SREBP1c的m RNA水平显著下降而PPAR-α的m RNA水平显著上升,LKB1、AMPK和ACC蛋白的磷酸化水平均显著回升。接着,将细胞内的LKB1敲低后发现,盐酸二甲双胍给药后产生的效应均被逆转,但是敲低Ca MKK2并没有明显的影响。（2）在体实验:HE染色和油红O染色显示,与对照组相比,乙醇暴露后,小鼠肝脏中形成了明显的脂肪空泡,肝脂积累严重,血清中的TG含量上升,ALT和AST均显著升高,提示AFL模型构建成功。同时,乙醇显著抑制小鼠肝脏内AMPK活性而激活ACC,盐酸二甲双胍给药可有效逆转上述变化。然而,将肝脏中LKB1敲低后,酒精性肝损伤再次加剧,AMPK水平显著下调,p-ACC水平也随之下降。（3）安全性评估:与对照组相比,盐酸二甲双胍连续给药两个月可显著降低小鼠血清TG水平而对心肝脾肺肾无明显影响。结论:（1）盐酸二甲双胍可通过激活LKB1/AMPK/ACC通路有效改善酒精引起的AML12细胞脂肪变性;（2）盐酸二甲双胍可通过激活LKB1/AMPK/ACC通路有效缓解小鼠AFL;（3）盐酸二甲双胍按每天200 mg/kg的剂量连续给药两个月并不会对小鼠造成明显脏器损伤。