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随着抗生素的应用,志贺菌耐药现象日益普遍,给细菌性痢疾的防治工作带来了一定困难。研究表明细菌的耐药机制涉及多个方面,其中主动外排泵可能起着较重要的作用。本课题组的前期研究已证实志贺菌中也存在AcrAB-Tolc主动外排泵及其调控基因marOR。在对acrAB-tolc泵基因的研究中,发现耐多药株的acrA mRNA水平明显高于敏感株,但acrAB-tolC基因突变株与未突变株中,其mRNA水平的差异无统计学意义；在对调控基因marOR的研究中发现,该基因第1376-1379位点有4个碱基的缺失存在于志贺菌耐多药菌株中而不存在于敏感株和参考株中,从而推测该基因突变可能引起外排泵表达水平增高,进而影响志贺菌的耐药性。
目的
在前期研究的基础上,本课题旨在研究志贺菌marOR、acrA、acrB和tolC基因的突变情况,调控基因marOR的突变对AcrAB-Tolc主动外排泵表达的影响及其与细菌耐药的关系。
方法：
1.菌株鉴定:在LB平板上划线复苏志贺菌菌株并重新进行血清学及生化鉴定。
2.药物敏感试验:采用Kinby-Bauer纸片琼脂扩散法,质控菌为ATCC25922。
3.有机溶剂耐受试验:能够在正己烷与环己烷比例为3:1的混合溶液中生长的菌株视为有机溶剂耐受菌株。
4.志贺菌marOR、acrA、acrB和tolC基因单链构象多态性(PCR-SSCP)分析:PCR扩增marOR、acrA、acrB和tolC基因,并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色,观察其单链构象多态性并照相。
5.核酸序列分析:根据SSCP分析结果,选择11株突变株和1株敏感株、1株参考株进行marOR基因测序。
6.志贺菌acrAB-tolC基因转录水平分析:利用TRIzol提取志贺菌的总RNA,按照逆转录试剂盒说明书进行第一链合成,PCR扩增目的片断,利用凝胶成像分析系统检测marOR突变组与未突变组中acrAB-tolC相对含量。
7.志贺菌株4个碱基缺失的marOR基因克隆及4个碱基缺失联合3个点突变的marOR基因克隆:利用重叠延伸PCR扩增4个碱基缺失的marOR基因,与T载体连接后转入DH5a,得到4个碱基缺失的克隆株；4个碱基缺失联合3个点突变的克隆株是直接扩增具有该突变菌株的marOR基因然后与T载体连接后转入DH5a所得。最后进行核酸序列分析进行证实。
8.marOR基因不同突变对细菌耐药性的影响:检测DH5a、转入T载体后的DH5a、完整marOR基因的DH5a克隆株、4个碱基缺失的DH5a克隆株及4个碱基缺失联合3个点突变的DH5a克隆株对多种抗生素的耐药性,并进行比较。
结果：
1.志贺菌菌株耐药性检测:159株志贺菌临床分离株对TE、C、AM、GM、NOR和SMZ-TMP等6种药物的药敏试验结果,敏感株4株,耐单药株18株,耐多药株137株,耐多药率为86.2％。
2.有机溶剂耐受试验:159株志贺菌中有122株对有机溶剂耐受,耐受率为76.7％。耐单药株的有机溶剂耐受率为83.3％,耐多药株的有机溶剂耐受率为75.9％。
3.志贺菌marOR、acrA、acrB和tolC基因单链构象多态性(PCR-SSCP)分析:在159株志贺菌临床分离株中,4株敏感株未发现marOR、acrA、acrB和tolC基因突变；155株耐药株中,marOR基因的突变率为17.4％；acrA基因的突变率为5.8％；acrB基因的突变率为3.9％；tolC基因的突变率为2.6％。
4.核酸序列分析:对参考株、敏感株(Z10)和11株marOR基因突变株的测序发现,与敏感株和参考株比较,8株突变株均存在1376-1379位点的4个碱基(CATT)缺失和3处点突变；另外3株耐药菌株中,菌株200011存在1381-1384位点的4个碱基(ATTT)缺失和包括以上3处点突变的多处点突变(与敏感株的匹配度仅有86％),菌株Z23存在5处点突变,菌株Z24存在2处点突变。
5.志贺菌acrAB-tolC基因转录水平分析结果:凝胶成像分析表明,突变组acrA、acrB、tolC表达的相对含量明显高于未突变组acrA、acrB、tolC的相对含量,P<0.05,差异有统计学意义。
6.marOR突变基因克隆:经过PCR扩增、基因克隆和核酸测序证实,已成功获得空载体克隆、无突变marOR基因、4个碱基缺失突变marOR基因及4个碱基缺失联合3个点突变marOR基因的克隆,分别记为DH5a(T)、DH5a(marOR),DH5a(marOR-ACTT)、DH5a(marOR-ACTT+3m)。
7.marOR突变对细菌耐药性的影响:按抑菌环直径相差5mm以上为抗生素耐药性有差别:与DH5a(T)比较,DH5a(marOR-ACTT)对链霉素、妥布霉素、先锋V、头孢氨苄的耐药性增加,DH5a(marOR-ACTT+3m)对链霉素和四环素的耐药性增加；与DH5a(marOR)比较,DH5a(marOR-ACTT)和DH5a(marOR-ACTT+3m)对链霉素、四环素、氯霉素、先锋V、左氟沙星、环丙沙星和氟哌酸的耐药性增加；DH5a(marOR-CATT)与DH5aT(marOR-CATT+3m)相比对除甲氧苄啶外的实验所用抗生素的抑菌环直径无明显差异。
结论：
1.在志贺菌耐药菌株中,marOR基因的突变率较高。在检测的11株志贺菌耐多药菌株中,8株marOR基因第1376-1379处有4个碱基的缺失和3个点突变,而该缺失突变和点突变不存在于敏感株和参考株中。
2.marOR基因突变的志贺菌的acrAB-tolC基因转录水平明显高于未突变菌株。
3.marOR基因第1376-1379处的4个碱基缺失,使志贺菌对部分抗生素的耐药性增加。
4.marOR基因第1411、1417、1435处的点突变对志贺菌的耐药性的影响较小。