背景与目的:帕金森病(PD)是常见的慢性进行性中枢神经系统(CNS)变性疾病之一,病因及发病机制不明。其病理学的变化主要为黑质多巴胺(DA)能神经元变性、缺失,导致纹状体DA不足。目前PD的治疗策略主要是控制临床症状,这种治疗策略不能够阻止疾病的进行性发展。细胞移植为PD提供了能够延缓疾病进展甚至根治的方法。可供移植的细胞从早期的DA能肾上腺嗜铬细胞、胚胎黑质细胞发展为神经干细胞、骨髓基质干细胞(MSCs),而MSCs作为移植细胞则具有明显优势。MSCs存在于骨髓间质中,具有自我复制能力;不仅可以分化为造血细胞,在特定条件下还可以分化为非造血细胞;MSCs来源丰富、采集方便;可自体回输,不会发生免疫排斥反应;体外扩增迅速,短时间内可以达到治疗所需的细胞数量;容易转入外源基因。因此,MSCs成为细胞移植治疗PD的最理想细胞来源之一。目前研究者多采用细胞因子或化学药物等方法调控MSCs分化,在体外扩增到一定数量级后再进行移植。微环境对于细胞的分化是最有利的条件。有实验表明周围神经组织能够促进黑质细胞生长。周围神经中除神经轴突外,主要包含雪旺细胞(SCs)和成纤维细胞(Fibroblast)。SCs是周围神经系统胶质细胞,据报道,SCs能够分泌20余种神经营养因子、细胞外基质及细胞黏附因子,为轴突基质提供支持。已证明SCs能够促进神经元轴突的再生,诱导轴突再生、延长,有利于受损神经在组织结构上修复、再生,在功能传导上再通。SCs在体外具有抑制胶质细胞生成,促进神经元快速生长的作用。将人胚胎干细胞与SCs共同培养,发现SCs营造的微环境可以诱导大多数干细胞分化为神经元。有实验证实周围神经可以促进黑质细胞的生长。研究发现,过表达FGF-20的SCs能够促进Nurr-1神经干细胞转化为酪氨酸羟化酶(TH)阳性的神经元。但是,SCs的获得存在技术复杂、所需试剂昂贵、SCs纯度不高等缺陷。关于Fibroblast报道较少。Fibroblast由胚胎时期的间充质细胞发展而来,是结缔组织中最常见的细胞,具有分泌功能,可以以自分泌和旁分泌的方式产生细胞外基质成分,如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)等。IGF-1具有胰岛素样抑制蛋白分解作用,同时也促进蛋白质合成,对正常组织细胞的增殖、分化、再塑和维护起十分重要的作用。IGF-1可促进神经细胞的存活,及促进视网膜神经元的发育和CNS多级神经元的生成。bFGF、EGF在包括神经系统在内的各种组织形成过程中发挥重要作用。目前研究者能够在体外实验中将MSCs诱导为神经元样细胞,表达神经元特有的表面标志。本实验利用细胞培养模型,模拟体内中脑微环境,将周围神经细胞悬液与MSCs混合建立共培养体系,观察MSCs向DA能神经元诱导分化的情况,目的是寻求体外诱导MSCs定向分化为DA能神经元的最佳条件,为PD的细胞及基因治疗奠定实验基础。方法:(1)MSCs的分离、培养及纯化雄性SD大鼠,无菌条件下暴露股骨和胫骨骨髓腔,获取骨髓液。采用贴壁筛选法,将骨髓液接种于含10%胎牛血清(FBS)的低糖DMEM(L-DMEM)培养液中,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养,24小时后首次换液。以后每3～4d换液一次,待贴壁细胞生长融合后,胰酶消化传代。将3～5代的MSCs接种于十二孔板中,待细胞生长达80%～90%融合时开始进行诱导分化。(2)周围神经细胞悬液的获取2.5 %苯丙巴比妥钠腹腔麻醉300～350g重的SD大鼠(雌雄不拘),无菌条件下取双侧坐骨神经,用显微外科镊子从神经束中逐条抽取神经纤维剪碎,移入盛有按1:1比例混合的0.5 %胰蛋白酶和0.06 %胶元蛋白酶的离心管内37℃水浴90分钟,加入细胞培养液终止酶反应,离心后将细胞稀释成3×105/L,置于37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中备用。(3)实验分组如下:L-DMEM培养基中加入FBS(体积分数15%)和bFGF(10ng/ml)预诱导MSCs24h后,分为对照组:不另加任何试剂。实验组:①MSCs+周围神经细胞悬液组;②MSCs+周围神经细胞悬液+中脑条件培养基组。整个诱导过程中,于倒置显微镜下密切观察细胞形态变化,并在诱导第7d时进行神经元特异性烯醇化酶抗体(NSE)、TH免疫细胞化学检测。分别计数NSE、TH阳性细胞数,计算阳性细胞百分比。结果:(1)MSCs在体外条件培养呈增殖性生长,传代后贴壁迅速,3～4d扩增1倍。(2)bFGF预诱导24h后细胞数量明显增加,部分细胞形态变为长梭形;部分细胞具有神经元形态学特征:折光性增强,胞体逐渐变成卵圆形或圆形,不带突起或向两极伸出突起。(3)各实验组于诱导7d后出现不同数量的NSE、TH阳性神经元样细胞。实验组与对照组NSE细胞阳性率、TH细胞阳性率有显著差异。(4)对照组未见TH阳性细胞,MSCs+周围神经细胞悬液组可见少量TH阳性细胞,MSCs+周围神经细胞悬液+中脑条件培养基组可见数量较多的TH阳性细胞。结论:(1)采用贴壁筛选法成功进行了SD大鼠MSCs的体外培养、传代、扩增。(2)bFGF可明显促进SD大鼠MSCs向神经元分化。(3)周围神经细胞悬液可体外诱导MSCs向神经元样细胞分化,表达神经元特异性标记物NSE。(4)周围神经细胞悬液与中脑条件培养基联合应用可诱导MSCs向DA能神经元分化,表达DA能神经元特异性标记物TH。