研究背景遗传性血色病(hereditary haemochromatosis，HH)是一种遗传性铁代谢疾病。发病遍及全球，以白种人发病较多，北欧人群发病率可高达1/200。大约1/10的白色人种是HFE基因突变携带者。HH主要特征为小肠铁吸收过量，逐渐在肝、心、胰和其它内分泌器官的实质细胞沉积，造成器官功能障碍、肝硬化、心力衰竭、糖尿病、垂体功能减退和关节疾病等。早期诊治可以阻止其各种并发症的发生。HH诊断后未经治疗，其10年生存率为6％，经静脉放血治疗后，其10年生产率可提高至70％。近年来国外学者发现HFE基因突变是引起HH的重要原因。HFE基因突变的主要形式为：C282Y突变：即核酸水平上第845位鸟嘌呤取代腺嘌呤(845G→A)引起蛋白水平第282位酪氨酸(Tyrosine)替代半胱氨酸(Cysteine)；H63D突变：即核酸水平上第187位鸟嘌呤取代胞嘧啶(187C→G)引起蛋白水平第63位天冬氨酸(Aspartate)替代组氨酸(Histidine)。85％的HH病人都可检测到C282Y突变，它是一个比较好的HH识别标记。HFE基因突变在不同种族间差别较大。据报道，在美国密歇根州高加索人种(白种人)调查中C282Y等位基因突变频率约为5.7％，H63D等位基因突变频率约为14.0％。在亚洲人种如台湾、香港、日本、韩国人群调查中未发现C282Y突变，而H63D突变频率约为2.2％。目前，中国大陆尚未见C282Y与H63D突变相关调查报道。研究目的一、调查中国河南汉族人HFE基因C282Y和H63D突变情况，了解我国河南HFE基因突变的发生频率及相关基因突变类型，为HH的早期发现、早期诊断和早期治疗提供遗传学筛查方法。二、了解HFE基因C282Y和H63D突变与机体铁超载的关系。对象血液标本：河南省成年健康汉族人血液标本600份，由河南省中心血站提供。经郑州大学第一附属医院检验科对以上600份标本进行肝功能、血常规检测，排除了不经分析就能影响血清铁指标的情况，如谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、血红蛋白(Hb)、血细胞比容(HCT)、平均红细胞容积(MCV)、白细胞(WBC)异常。本实验排除82例异常标本，对518例健康献血人群血样本进行分析。其中男性293位，女性225位，年龄在18～50岁，年龄均值(±SD)为29.30±9.74岁。所有受试者无心血管、肝脏、肾脏及内分泌紊乱引起的临床及生化表现。方法留取EDTA抗凝血2ml用于血液DNA提取和PCR分析。留取干燥试管血液标本5ml，离心并分装血清，用于检测血清铁指标。1．C282Y与H63D基因型分析：对以上518个样本利用PCR技术与限制性内切酶技术分析C282Y与H63D突变情况。从EDTA抗凝血中提取基因组DNA。参照文献设计引物，进行两个区域的PCR基因扩增，利用2％的琼脂糖进行电泳，紫外透射分析仪观察。选取扩增特异性良好的PCR样本分别进行RsaⅠ(C282Y)和MboⅠ(H63D)限制性内切酶酶切，反应物利用2％的琼脂糖进行电泳。应用凝胶成像系统进行成像处理。2．铁指标测定：利用铁试剂盒和总铁结合力试剂盒及人血清铁蛋白酶联免疫定量检测试剂盒同时测定518个样本的血清铁浓度、总铁结合力和铁蛋白。血清铁除以总铁结合力乘以100％得到转铁蛋白饱和度(transferrin saturation，TS)。结果1．C282Y与H63D基因型：518个样本未见C282Y突变情况；对H63D检测中，发现22个杂合突变，余496个为正常纯合子。H63D杂合基因突变频率为4.2％，等位基因突变频率为2.1％。利用两样本率的u检验方法比较河南汉族人与高加索人C282Y和H63D基因突变频率的差别。经统计学分析，二者差异具有统计学意义(P<0.05)。2．血清铁指标测定：在518个中国河南汉族人样本中，男性平均年龄29.52±9.58岁，女性平均年龄29.07±9.97岁。测得TS值(±SD)为41.7±15.4％，SF值(±SD)为116±53ng/ml，均高于高加索人TS和SF值(24.6±5.8％和99±51ng/ml)。利用成组设计资料的u检验方法比较二者的差异。经统计学分析，二者差异具有统计学意义(P<0.05)。男性TS(43.7±15.6％)和SF(142±65ng/ml)均高于女性(37.3±13.9％)和(91±53ng/ml)，在年龄与TS和SF之间，无论男性，还是女性都无明显相关性。3．H63D基因型与血清铁：H63D杂合突变型C/G杂合子TS值为43.9±15.5％，SF值为119±53ng/ml；H63D未突变型C/C纯合子TS值为40.1±15.7％，SF值为102±46ng/ml，利用成组设计资料的t检验方法比较河南汉族人H63D突变组与未突变组铁指标的差别。经统计学分析，差异无统计学意义(P>0.05)。结论1、HH的危害性大、无创性的HFE基因检测的诊断方法简单、实用，本试验通过对中国河南汉族人HFE C282Y和H63D基因突变频率调查，为开展新生儿期遗传筛查提供了方法；为HH患者的早期诊断、早期治疗和早期预防开辟了道路。2、中国河南汉族人HFE基因突变频率低于欧洲、北美洲白种人，这种HFE基因突变频率的差异可能是中国人遗传性血色病发病率低于欧洲、北美白种人的原因之一。3、单纯H63D杂合突变不引起TS和SF的增高，不会引起遗传性血色病的发生。中国河南汉族人TS和SF值较高加索人高并非由C282Y与H63D突变引起。4、本项调查清晰地反映了河南汉族人HFE基因突变的发生频率、类型及与血清铁的关系，为本病的进一步流行病学研究提供了依据。