溶原性噬菌体(1ysogenic phage)在苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis,B.t)中存在率高达80％，在苏云金芽孢杆菌的前期发酵过程中溶原性噬菌体会随机爆发，轻则减产，重则倒罐。通过对B.t生产菌株溶原性噬菌体的生物学特性和基因组学的研究可以进一步认识和控制溶原现象、噬菌体的侵染及溶原机制、噬菌体与宿主的关系和微生物杀虫剂的商品化等均具有理论和实际的意义。 本文选取来自广东梅州某公司的九株B.t生产菌株(代号为Mz1-9；主要研究MZ1菌株，血清型H<,3a3b>)及本实验室保存的113株B.t标准菌株和野生菌株为研究对象。生产菌株经纯化并使用丝裂霉素C诱导后，用交叉裂解法获得相应的指示菌，在双层琼脂平板上清楚地观察到七株生产菌株相应的噬菌斑，从而证明了这七株生产菌株为溶原菌，并对这些菌株进行了发酵特性试验。首次报道了PCR方法检测B.t的溶原性噬菌体，以发表的噬菌体GIL01基因组中的第30号基因的序列设计了一对引物，以本实验室保存的随机选取的35株B.t标准菌株和生产菌株MZ1的培养物作为模板，从包括MZ1在内的16株菌株中扩增出大小约750bp预期的目的片段。通过指示菌的方法验证了这一结果，说明PCR法检测B.t的溶原性是可行的。 对生产菌株MZ1不同形状的噬菌斑进行连续的分离纯化后，获得了两种不同大小的噬菌斑，说明该菌株可能为二元溶原菌。其噬菌体分别命名为MZTP01(大斑，作为主要研究对象)和MZTP02(小斑)。分别检测到噬菌体MZTP0l和MZTP02至少有五株和六株的宿主菌；两噬菌体对pH值、紫外线和热的稳定性相差较大；中和反应的K值分别为326和45，且两者无相关抗原性；噬菌体MZTP01的裂解量为175，比MZTP02大两倍；潜伏期为40分钟，比MZTP02少一倍。SDS-PAGE电泳显示两噬菌体有七至八条结构蛋白带型，分子量在16kDa～48kDa之间；核酸试验表明两噬菌体均为双链DNA线型分子，分子量均为15kb左右。 提取噬菌体MZTP01DNA，分别采用鸟枪法和primer—walking法进行基因组全序列的测定(登录号为AY894696)。分析结果表明，该噬菌体基因组有15717bp的碱基对，G+C的含量为37.55％，有20个ORF，其中有14个ORF与噬菌体蛋白直接相关，还有6个未知的ORF。对基因组中各基因的位置、大小、启动子及酶切图谱进行了全面标定。通过基因组间的比较，发现它与蜡状芽孢杆菌(Bacilus cerens，B.c)的B1家族噬菌体最相近，但它与已经测序的B.t的三个噬菌体基因组作比较时，除了序列大小相近之外，在蛋白功能上相差很远。此外，测定了MZTP02 DNA基因组的C、D和E三个酶切片段的序列并登录Genbank(登录号分别为AY973586、AY639599和AY973585)。 分别对生产菌株MZl两种噬菌体的与尾巴有关的基因(tmp)、胞壁质酶基因(mur)、肽酶基因(pep)和复制调控基因(ogr)进行了克隆、原核表达和蛋白质功能的分析。 根据对tmp基因进行的生物信息学分析结果，推测该基因为晚期表达的结构蛋白编码基因。通过TMP蛋白的同源性比较，绘制了以该噬菌体基因为基础的进化树。从MZTP01的基因组中克隆了该基因，用pQE30作为表达载体，在E.coli中获得了35kDa的蛋白质条带。在噬菌体悬液中加入该蛋白的多克隆抗体后，双层琼脂平板检测出噬菌体的滴度下降了约100倍。说明该蛋白的功能与噬菌体尾巴形成过程有关，并可能与宿主细胞壁上的噬菌体吸附位点相结合。 从MZTP01的基因组中克隆了mur基因，并连接到pQE30表达载体上。经IPTG诱导后，该蛋白在E.coli中获得了表达，Western b10t显示产物位于32kDa附近。在含有细胞壁的SDS—PAGE电泳中观察到该复性蛋白具有分解细胞壁的能力，在蓝色背景的胶片中出现了细胞壁被蛋白降解后的白色条带，因而这种蛋白是一种胞壁质酶。 从MZTP02D酶切片段中亚克隆了pep基因，用pQE30作为表达载体，在E.coli中获得了过量表达的蛋白质，Western b10t检测显示产物位于47kDa附近。该蛋白质以包含体的形式存在，通过变性和复性处理，利用Ni-NTA agarose对该表达蛋白进行纯化，获得了相应的目的蛋白。经检测，发现该蛋白有水解酪氨酸的能力，其活力相当于O.3mg/m1的胰蛋白酶，是一种肽酶。 从MZTP02 D酶切片段中亚克隆了ogr基因，分析显示该基因含有晚期表达基因的启动子序列，推测为协助晚期表达的调控蛋白。通过OGR蛋白的同源性比较，绘制了以该ogr基因为基础的噬菌体进化树。用pOE30作为表达载体转化E.coli，以18％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳获得了约8kDa的表达带。经可溶性试验表明，它以可溶性的形式存在，估计具有参与复制从而控制溶原与裂解转换的功能。