论文部分内容阅读
牙鲆（Paralichthysolivaceus）是我国重要的海水经济鱼类，具有重要的商品价值。很多研究表明，三倍体鱼类除了在生长等性状方面的优势外，在生殖方面具有低育性和不育性。正是因为三倍体鱼在生殖方面独特的不育性，近年来伴随分子生物学和基因重组技术的发展，利用转基因技术培育带有特异标记的品系，对原始生殖细胞（PGC）进行标记、分离，经过显微操作技术实现原始生殖细胞的移植，在鱼类生殖细胞移植方面不育的三倍体可以作为理想的受体鱼。不育的三倍体鱼在接受外源生殖细胞移植后，可以排除内源性生殖细胞的干扰。本文以牙鲆和圆斑星鲽（Veraspervariegatus）为研究对象，首先对圆斑星鲽的精子进行了冷冻保存实验，然后用静水压法诱导牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体和四倍体，筛选了最佳诱导条件，得到生殖细胞移植需要的三倍体。主要结果如下：1.将圆斑星鲽精子收集后，超低温冷冻保存，筛选出HBSS作为冷冻稀释液，15%DMSO作为冷冻保护剂。对解冻后的圆斑星鲽精子进行受精实验，受精率能达到（61.00±2.00）%，同时对精子激活后的运动率进行了检测，解冻后激活的精子的存活时间会显著缩短，解冻后的精子的存活时间大约为150s，激活后的新鲜精子存活时间大约为250s。经过冷冻后的精子其形态特征会受到损伤，其生理活性也会下降。2.本研究利用牙鲆（♀）和圆斑星鲽（♂）的配子受精后，用静水压法抑制受精卵第二极体的排出，诱导杂交三倍体。并筛选出最佳的诱导条件。实验证明，静水压法可以诱导出牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交三倍体，诱导率主要受到受精后处理起始时刻、处理压强和压强处理时间三个因素的影响。静水压法的最佳诱导条件为：在海水温度为15℃±0.2℃时，受精后3min起，以70MPa压力处理6min，此时相对孵化率为（24.06±1.10）%，利用倍性分析仪对其进行倍性鉴定，三倍体率为（26.67±6.67）%。染色体分析表明，三倍体胚胎的染色体数目为71条，对照组二倍体胚胎的染色体数目为47条。还发现了少量染色体数目为24条的单倍体胚胎。3.本研究还利用牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）杂交后的受精卵，用静水压法抑制第一次卵裂进行杂交四倍体的诱导，实验结果表明，用静水压法在在海水温度为15℃±0.2℃时，在（P，65MPa；D，6min；TA，100-110min）可以诱导出牙鲆（♀）×圆斑星鲽（♂）的杂交四倍体。但是在诱导过程中，胚胎发育到原肠期时会大量死亡，孵化率非常低。染色体观察发现，除了能诱导出四倍体外，在胚胎中还发现有嵌合体的存在。