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[目的]
肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是由激活的巨噬细胞产生的一种多功能细胞因子，其最显著的特征是在体内外直接杀伤肿瘤细胞，是一种具有潜在应用价值的抗肿瘤生物制剂。随着分子生物学技术的飞速发展，应用基因工程手段制备高效低毒的hTNF-α突变体和其肿瘤靶向性的TNF-α融合蛋白呈现出较好的应用前景。本课题根据肿瘤组织一般高分泌MMPs特点，构建MMPs介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白表达质粒，使融合蛋白特异性地靶向于肿瘤组织，肿瘤组织高浓度的MMPs水解其底物序列，暴露出hTNF-α受体结合部位。hTNF-α与其受体结合后，诱发一系列的细胞凋亡信号转导途径，从而杀伤肿瘤细胞。
[方法]
1.构建pET-42a(+)-foldon载体合成含有foldon序列的引物，对pET-42a(+)质粒进行PCR，将PCR产物和pET-42a(+)质粒同时进行双酶切，连接，转化。筛选阳性重组子并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切鉴定、PCR鉴定和DNA测序分析。
2.构建四种重组质粒对本课题组构建好的pET-32a(+)-collagen-MMP1，8a-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP1，8b-hTNF-α、pET-32a(+)-collagen-MMP2，9a-hTNF-α和pET-32a(+)-collagen-MMP2，9b-hTNF-α四种克隆质粒用相对应的引物分别进行PCR，得到的PCR产物片段中分别含有MMP1-hTNF-α、MMP8-hTNF-α、MMP2-hTNF-α、MMP9-hTNF-α，对PCR产物和pET-42a(+)-foldon质粒同时进行双酶切，连接，转化。筛选阳性重组子并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定、双酶切鉴定、DNA测序分析。
四种重组质粒质粒分别命名为：pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α；
3.蛋白表达产物的鉴定及条件的优化用终浓度为1mmol/L的IPTG诱导蛋白表达，对产物进行SDS-PAGE检测。在蛋白基本表达的基础上，对诱导温度、诱导剂浓度及表达时间等条件进行优化，按照Novagen公司蛋白提取试剂盒(BugBuster Protein Extraction Reagent)方法进行提取，分别收集上清和沉淀中融合蛋白，进行SDS-PAGE检测，然后利用Bandscan软件分析，确定融合蛋白的可溶性表达条件。
4.蛋白纯化
1)按照Novagen公司GST-Bind Resin试剂盒方法纯化融合蛋白，SDS-PAGE鉴定融合蛋白的纯化产物。
2)纯化蛋白总含量的测定。
按Bradford酶标板蛋白测定法检测纯化产物的含量。
3)用凝血因子(Factor Xa)切除载体标签5.基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-8和MMP-2、MMP-9)对融合蛋白的去封闭效果研究分别用MMP-1、MMP-8、MMP-2和MMP-9酶切相对应的融合蛋白，SDS-PAGE鉴定酶切条带。
6.融合蛋白生物学活性的初步研究以hTNF-α标准品为参照，对带有GST标签的融合蛋白(即GST-foldon-MMP1-hTNF-α)、切除GST标签的融合蛋白(即foldon-MMP1-hTNF-α)、经MMP1酶切的融合蛋白(即rhTNF-α)，利用MTT法检测融合蛋白的细胞毒性。
[结果]
1.成功构建了pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α四种质粒；
2.确立了pET-42a(+)-foldon-MMP1-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP8-hTNF-α、pET-42a(+)-foldon-MMP2-hTNF-α和pET-42a(+)-foldon-MMP9-hTNF-α四种质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)的表达条件，实现了四种rhTNF-α融合蛋白的高效、可溶性表达。
3.确定了融合蛋白的纯化方案，成功切除了融合蛋白上的载体标签。
4.初步验证了基质金属蛋白酶(MMP-1、MMP-8和MMP-2、MMP-9)对融合蛋白的去封闭效果。
5.融合蛋白具有细胞毒作用，能诱导肿瘤细胞凋亡。
[结论]
构建了四种基质金属蛋白酶介导的肿瘤靶向性rhTNF-α融合蛋白表达载体，优化了其在大肠杆菌系统中表达的条件，实现了高效、可溶性表达；获得了切除载体标签后的四种融合蛋白，四种融合蛋白能诱导高表达MMPs的肿瘤细胞凋亡。