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目的：膀胱尿路上皮癌是我国泌尿系统中最常见的一种恶性肿瘤，发病机制尚未阐明，肿瘤多发难治、复发率高，严重威胁人类健康。miRNA是近年来发现的一种小分子RNA，通过调节原癌基因或抑癌基因等机制参与肿瘤细胞的增殖、分化及凋亡等过程，其差异表达可以作为肿瘤早期诊断、判断疗效及预后的指标。通过对膀胱尿路上皮癌和正常膀胱尿路上皮组织miRNA芯片分析(膀胱尿路上皮癌标本20例、正常膀胱尿路上皮组织3例)，筛选出肿瘤浸润相关特异性miRNAs；针对肿瘤浸润相关特异性miRNAs，设计特异性的引物，利用RT-PCR进行验证(膀胱尿路上皮癌标本17例、正常膀胱尿路上皮组织5例、4型膀胱尿路上皮癌细胞株EJ、5637、T24、BIU-87各1株)。为下一步研究膀胱尿路上皮癌浸润相关特异性miRNA的功能及致癌机制提供一个良好的平台。
方法：
一、miRNA芯片杂交，筛选肿瘤浸润相关特异性miRNAs
1.随机收集新鲜膀胱尿路上皮癌及正常膀胱尿路上皮组织(23例)保存于液氮中：20例膀胱尿路上皮癌标本(4例为膀胱全切术于癌肿中心处取材，16例为膀胱镜检查活检取材)，按国际抗癌协会的2002年第六版TNM分期法分为浸润组12例、非浸润组8例。3例正常膀胱尿路上皮组织，取材于成人尿道下裂手术；2.Trizol试剂提取总RNA；3.紫外吸收测定法及变性琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测；4.标记酶Hy3TM荧光基团标记RNA的探针和mi RCURYTM芯片杂交；5.用GenePix4000B芯片扫描仪及GenePix pro V6.0进行图像采集和数据分析(t检验)，获得肿瘤浸润相关特异性miRNAs。
二、RT-PCR
1.重新随机收集新鲜膀胱尿路上皮癌及正常膀胱尿路上皮组织(22例)保存于液氮中：17例膀胱尿路上皮癌标本，均为膀胱镜检查活检取材，参照上述标准分为浸润组14例、非浸润组3例。收集5例正常膀胱尿路上皮组织，2例于膀胱镜检查活检取材、2例为膀胱全切术于正常粘膜处取材(经资深病理学医师指导取材并经病检证实)、1例取材于成人尿道下裂手术。购置膀胱尿路上皮癌细胞株4型(EJ、5637、T24、BIU-87各1株)；2.Trizol试剂提取总RNA；3.紫外吸收测定法及变性琼脂糖凝胶电泳进行RNA质量检测；4.合成cDNA；5.RT-PCR分析所收集标本和购置膀胱尿路上皮癌细胞株中hsa-miR-200a、hsa-miR-200c、hsa-miR-141、has-miR-429、has-miR-451的表达情况并进行数据分析。
结果：
1.非浸润性膀胱尿路上皮癌与正常膀胱尿路上皮组织共有52个差异表达基因，上调的12个，下调的40个；
2.浸润性膀胱尿路上皮癌与正常膀胱尿路上皮组织共有37个差异表达基因，上调的11个，下调的26个；
3.浸润性膀胱尿路上皮癌与非浸润性膀胱尿路上皮癌有7个差异表达基因，上调的6个：hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-378、hsa-miR-429、hsa-miR-200c、hsa-miR-141，下调的1个：hsa-miR-451；
4.非浸润性膀胱尿路上皮癌与浸润性膀胱尿路上皮癌中共同上调的：hsa-miR-29b-1*，共同下调的：hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-208、hsa-miR-451、hsa-miR-183*、hsa-miR-300、hsa-miR-185、hsa-miR-144、hsa-miR-24-2*、hsa-miR-215、hsa-miR-923；
5.hsa-miR-200a、hsa-miR-200c、hsa-miR-141、has-miR-429、has-miR-451的RT-PCR验证结果与基因芯片结果一致；
6.选取的4型膀胱尿路上皮癌细胞株(EJ、5637、T24、BIU-87)，hsa-miR-200a、hsa-miR-141、has-miR-429、has-miR-451在EJ细胞株中的验证结果与基因芯片结果不一致；hsa-miR-141在5637细胞株中的验证结果与基因芯片结果不一致；hsa-miR-200a、has-miR-429在BIU-87细胞株中的验证结果与基因芯片结果不一致；5个miRNAs在T24细胞株中的验证结果与基因芯片结果均一致。
结论：
1.膀胱尿路上皮癌与正常膀胱尿路上皮组织存在差异表达miRNAs；
2.膀胱尿路上皮癌的发生、浸润、进展与miRNA的差异表达密切相关；
3.浸润性膀胱尿路上皮癌与非浸润性膀胱尿路上皮癌中有显著差异表达的7个miRNAs：hsa-miR-29c、hsa-miR-200a、hsa-miR-378、hsa-miR-429、hsa-miR-200c、hsa-miR-141、hsa-miR-451为膀胱尿路上皮癌具备浸润性生物学行为的重要原因；
4.hsa-miR-200c在EJ细胞株与膀胱尿路上皮癌标本中RT-PCR结果一致，hsa-miR-200a、hsa-miR-200c、hsa-miR-429、hsa-miR-451在5637细胞株与膀胱尿路上皮癌标本中RT-PCR结果一致，hsa-miR-200c、hsa-miR-141、hsa-miR-451在BIU-87细胞株与膀胱尿路上皮癌标本中RT-PCR结果一致，T24细胞株与膀胱尿路上皮癌标本中miRNAs的差异表达完全一致。这些珍贵的资料为下一步研究膀胱尿路上皮癌浸润相关特异性miRNAs的功能及致癌机制提供一个良好的平台。