心脑血管疾病是当前危害人类健康的头号杀手，其全球发病率在20～30％之间。心脑血管疾病的主要致病根源是血管的病变，多数心脑血管疾病可归为血管性疾病。血管性疾病是多种病因的综合结果，目前用于临床治疗的药物种类很多，部分药物已被临床实践证明具有良好的治疗效果。但是，这些药物往往需要病人终生服用，而且很多药物经过长期使用却并未降低疾病的死亡率。因而新型血管性疾病防治药物的发现一直是医药科学研究者们努力的方向。本论文在认识药物靶点的基础上，对靶点药理学作用进行适当评估，建立筛选模型，通过筛选发现先导化合物。主要从以下几方面开展防治血管性疾病新药发现的研究： 一、糜酶的重组表达及其抑制剂的高通量筛选肾素-血管紧张素系统参与了各种血管性疾病的发生和发展过程。该系统中除了ACE以外，还有糜酶也能催化Ang I生成Ang II，构成了Ang II生成最重要的旁路。近年来研究发现，糜酶在多种血管性疾病的发病过程中起了重要作用，它已经成为一个重要的药物靶点，但糜酶抑制剂尚处于临床前研究阶段。仓鼠糜酶2与人糜酶同属于α糜酶，两者的蛋白序列同源性较高，目前关于糜酶的研究多数在仓鼠中进行。我们首先对仓鼠糜酶2基因进行了克隆，并分别在毕赤酵母和大肠杆菌两个表达体系中对糜酶2进行了重组表达。结果发现糜酶2在毕赤酵母中表达量很低，而在大肠杆菌中表达量极高，同时又证明了在大肠杆菌中表达的糜酶2具有水解Ang l为Ang II的活性。在成功表达糜酶2的基础上，我们建立了糜酶抑制剂的高通量筛选模型，该模型具有快速、高效、稳定的优点。应用该模型，筛选样品库中40080个样品，又对其中的807个样品进行了复筛，最终发现了有52个化合物和102个中药样品具有抑制糜酶的活性，其中有两个化合物的IC50在1μM以下。 二、尾加压素II的血管效应及其受体稳定转染细胞株的建立尾加压素II(UII)是迄今发现收缩血管活性最强的物质，其受体即UII受体是最近发现的一种G蛋白偶联受体。研究发现，UII在各种血管性疾病中扮演着极其重要的角色，已成为治疗高血压、动脉粥样硬化等血管性疾病的重要潜在靶点。我们对UII这一个新靶点的功能进行了初步研究首先考察了UlI对大鼠胸主动脉的收缩血管作用，结果发现，在连续给予UII刺激后，可出现明显的脱敏现象，去除内皮对脱敏现象无明显影响，而NOS抑制剂L-NAME能够显著抑制UII的脱敏现象，该结果表明UIl的脱敏可能与血管平滑肌中NOS有关。随后研究发现，在去除内皮的血管中UII的脱敏能够被iNOS抑制剂氨基胍所抑制，而nNOS抑制剂亚精胺则无效。最终确定UIl脱敏机制与其激活血管平滑肌中iNOS的活性有关。在此基础上，又考察了UII对大鼠血管平滑肌细胞中各种血管损伤相关因子表达的影响。结果显示，UII对血管平滑肌细胞的iNOS和VEGF的mRNA表达水平有很强的促进作用，而且UII促进VEGF表达的作用与自由基的生成有关。血管外膜在血管重构过程中起了重要作用，研究结果表明UII能够明显促进外膜成纤维细胞表型向肌成纤维细胞改变。α平滑肌肌动蛋白的表达是外膜成纤维细胞表型改变的一个重要指标。UII(100 μM)作用48 h后，细胞中α平滑肌肌动蛋白表达显著升高，而且其表达能够被自由基清除剂所抑制，说明UII对外膜成纤维细胞表型的改变作用也与自由基有关。为了更好地了解UII受体的功能，我们又在哺乳动物细胞中重组表达了UII受体。从人基因组中成功克隆了UIl受体的基因，以pcDNA3.1(+)作为表达载体构建了真核细胞表达质粒，将质粒转染入CHO细胞中，经过G418筛选，建立了UII受体的稳定转染细胞株。该细胞株的建立为UIl受体功能的研究以及受体结合药物的筛选提供了必要的物质条件。 三、植物GL中收缩血管活性物质的发现GL是一个草本植物，民间用于高血压的治疗取得了很好的疗效。本实验室之前也在正常大鼠和自发性高血压大鼠上观察到GL的提取物具有一定的降压作用，但是在离体血管环实验中非常意外地观察到GL提取物具有很强的收缩血管活性。为了解释其中的缘由，我们对GL中的血管活性物质进行分离和鉴定。通过综合应用提取、分离、血管活性鉴定和化学结构鉴定等方法，成功分离并鉴定了GL中的收缩血管物质，它是一个结构全新的化合物。 四、匹诺塞林的舒张血管作用及其机制的研究天然产物是药物发现的重要来源之一，通过筛选，我们发现了具有舒张血管作用的天然产物匹诺塞林。5～100 μM匹诺塞林能够呈剂量依赖性地舒张NE和KCI预收缩的大鼠胸主动脉，而且30 μM和50μM匹诺塞林对NE和KCI的收缩血管效应也有明显的抑制作用。匹诺塞林的舒张血管作用部分依赖于内皮，NOS抑制剂和鸟苷酸环化酶抑制剂亚甲蓝能够抑制它的舒张血管作用，而环氧合酶抑制剂吲哚美辛则没有明显的作用。在去除内皮的血管环中，高浓度匹诺塞林的舒张血管作用能被钾通道阻断剂格列苯脲、TEA和4-AP所阻断。在去除内皮的血管环中，高浓度匹诺塞林也能够明显抑制无钙KH液中NE引起的短暂收缩以及无钙高钾KH液中氯化钙引起的血管收缩。本研究提示匹诺塞林既通过促进内皮细胞释放NO，激活cGMP通路引起血管舒张，也通过直接作用于血管平滑肌开放钾通道、阻滞钙通道发挥舒张血管作用。 本论文通过对四种不同的具体研究内容，对药物发现过程中的靶点确证、模型建立和筛选、活性化合物的获得和评价等重要环节进行了研究，探讨了新药发现的特点和规律，为新药研究提供了实验基础。