华法林是一种双香豆素衍生物，是临床上常见的口服抗凝药物，主要用于预防和治疗血栓性疾病。但其有效治疗范围较窄且不同个体之间维持剂量存在较大差异性，使其在临床应用比较棘手，剂量偏小会降低治疗血栓形成的效果，剂量偏大则会增加出血的风险，甚至引发大出血等副作用。　　 华法林的所有制剂都是消旋混合物，S(-)-对映体(左旋华法林)是消旋华法林片剂的主要有效成分。华法林主要是由肝细胞微粒体细胞色素P450(Cytochromo P450，CYP)羟基化后，由肾脏排出体外。S(-)-对映体主要经CYP2C9酶催化生成6-和7-羟基华法林：而R(+)-对映体则由CYP1A1、CYP1A2、CYP3A4和CYP2C19酶代谢[1]。S(-)-对映体抑制还原型维生素K再生的能力较强，是R(+)-对映体的3～5倍。维生素K环氧化物还原酶(VKOR)是华法林作用的靶蛋白。华法林通过抑制VKOR，使无活性的氧化型(环氧化物型)VK无法还原为有活性的还原型(氢醌型)VK而起到抗凝作用[2]。　　 造成华法林用量个体差异的因为很多，可分为非遗传因素和遗传因素。非遗传因素主要有年龄、性别、体表面积、药物的相互作用、饮食习惯和疾病状态等。然而，非遗传因素的影响程度较为仃限，并非华法林用量个体差异的主要因为。近年来，随着药物基因组学的进展和华法林药理作用分了机制的阐明，遗传因素在华法林用量个体差异中的作用越来越受到人们的重视。目前，已知与华法林的药效学和药动学相关的基因达30余种。因为CYP2C9是影响华法林代谢的主要酶之一，因此许多研究表明细胞色素P450多态性和华法林的剂量和代谢的个体差异有非常重要的关系[3]。　　 目前国内外关于华法林临床抗凝效果的监测是采用凝血酶原时间比值(PTR)和国际标准比值(INR)进行。此类检查属于定性检查，方法简便，但特异性差.影响实验结果的因素多。在抗凝治疗早期，INR及PT反映的实际上是血浆中FⅦ的活性变化情况，并不能完全代表华法林体内的全部抗凝效应[4]。有文献报道[5]在服用华法林72 h内INR较服药前无明显变化，72 h后INR才较服药前呈现显著变化。由于多数病人口服华法林抗凝需长期用药，达到有效作用所需药物剂量之间的差异较大，因此通过测定血中华法林对映体浓度来预测安全有效的个体化给药剂量，是目前国外华法林临床药理研究的热点[6]。　　 目前华法林相关基因多态件的研究大多集中在白种人群或其他种族，但由于基因的遗传变异频率存在明显的种族差异，国内虽然也有报道基因多态性对华法林维持剂量的影响，但所选取的病例数有限，并且国内外对基因多态性与华法林对映体血浆浓度的相关性研究不是很多。因此，阐明中国汉族人群中华法林相关基因多态件与其维持剂量和其血浆浓度之间的关系是迫切需要的，本研究旨在探讨CYP2C9平CYP3A4基因型与华法林维持剂量及其对映体血浆浓度的个体差异的关系，因此本研究分基因分型检测和血药浓度分析两部分章节。　　 第一章 CYP2C9和CYP3A4基因型对华法林维持剂量的影响　　 研究目的：探讨CYP2C9和CYP3A4基因多态件对心脏瓣膜置换术后患者的华法林维持剂量的影响，将遗传因素和非遗传因素结合起来，为临床个体化给药提供方案。　　 对象与方法：(1)病例筛选，符合入选标准和排除标准的患者个人资料和临床资料的收集，剔除在研究过程中资料不够完善以及结果欠缺的病例；(2)候选基因的选取，对所有入选病例进行SNP基因分型检测；　　 1)研究对象　　 本研究所选取的病例均为2000年7月～2008年9月在广东省人民医院进行了心脏瓣膜置换术，术后一直服用华法林抗凝治疗并接受随访的患者，经过筛选最后入选的有636例。所有病例都经过至少一个月的调整，华法林抗凝治疗进入维持阶段，并且国际标准化比值(INR)在2.0～3.0之间。　　 2)收集资料　　 我们对636例已达华法林维持剂量的临床病人进行了个人资料和临床资料的收集，我们详细记录了患者的性别、年龄、体重、身高、是否吸烟、饮酒、瓣膜位置、合并疾病以及华法林维持剂量等。　　 3)选择SNP　　 对于SNP的选择，本研究根据最初筛选的标签SNP、功能性SNP、已发表的文献资料以及最小等位基因频率(MAF≥2％)对CYP2C9和CYP3A4的SNP进行了选择。最后入选的CYP2C9的SNP为rs1057910、rs12572351、rs1934967、rs1934968、rs4917639、rs9332146；CYP3A4的SNP为rs2242480、rs2246709。　　 4)基因分型　　 取患者血样4 mL置于硅烷化的EDTA抗凝管，颠倒几次。立即将血样送呈实验室分离白细胞，用TIANGEN公司DNA分离试剂盒提取基因组DNA(TiangenBiotech，Beijing，China)。标本冻存于-70℃低温冰箱。最后确定的CYP2C9和CYP3A4基因的8个SNP的基因型通过基于单碱基引物延伸原理的MultiplexSNaPshot SNP分型技术(ABI Prism SNaPShotTM Multiplex kit，ABI，Foster City，CA，USA)对所有的DNA样本进行SNPs基因型检测。　　 结果：　　 ①华法林维持剂量与年龄呈负相关(r=-0.228，P<0.0001)，和BSA呈正相关(r=0.151，P<0.0001)，但是性别、是否吸烟、饮酒、不同厂家不同规格的华法林片剂、瓣膜位置、以及合并疾病与华法林维持剂量未见显著的相关性。　　 ②CYP2C9基因的3个SNP(rs9332146、*3 rs1057910和rs4917639)与华法林维持剂量有显著的相关性，分别可以解释0.7％、3.6％和1.8％的华法林剂量差异。携带CYP2C9 rs 9332146G>A杂合型(GA)的患者所需华法林维持剂量为2.59mg，要低于携带野生型(GG)的患者的华法林用量2.95mg(F=4.306，P=0.038)；携带CYP2C9 rs1057910 A>C杂合型(AC)和纯合突变型(CC)的患者所需的华法林维持剂量分别为2.32mg和1.5mg，都低于携带野生型(AA)患者的华法林平均维持剂量2.98mg(F=4.745，P=0.000)。携带CYP2C9 rs4917639 G>T杂合型(TG)的患者所需华法林维持剂量(2.65mg)要比携带纯合突变型(TT)的患者的华法林维持剂量2.99要低(F=5.660，P=0.004);　　 ③CYP3A4基因的2个SNP位点不同基因型组之间华法林维持剂量的差异无统计学意义。　　 结论：　　 ①CYP2C9基因型对华法林维持剂量有影响，尤其是CYP2C9 rs1057910位点的基因多态性与华法林维持剂量具有相关性，携带CYP2C9 rs1057910的C突变等位基因的患者所需华法林维持剂量要减少。　　 ②CYP3A4基因型对华法林维持剂量无影响。　　 ③年龄和BSA对华法林维持剂量有一定的影响，结合遗传和非遗传因素可以更好地指导临床个体化用药。　　 第二章 CYP2C9和CYP3A4基因型对华法林对映体血浆浓度的影响　　 研究目的：通过建立高效液相色谱法检测血浆中华法林对映体浓度，探讨CYP2C9和CYP3A4基因型对华法林对映体血浆浓度的影响。　　 对象与方法：采用高效液相色谱法对所有入选标本的血浆样本进行华法林对映体血药浓度的检测。　　 ①研究对象：636例被检测的患者，均按规律服药达1周以上(5个半衰期)，测定其稳态血药浓度。采血时间为次日空腹且末次服药与采血时间间隔为11～13个小时。　　 ②高效液相色谱法分离华法林对映体：华法林对映体R(+)-华法林和S(-)-华法林由美国Sigma-Aldrich公司提供，萘普生(内标)，乙腈HPLC试剂。仪器：岛津LC-10ATVP色谱系统；色谱条件：手性-AGP色谱柱(ULTRON ES-OVM51μm，150×4.6mm)，保护柱(ULTRON ES-OVM.G 10×4.6mm)。流动相：乙腈：20mM磷酸盐缓冲液(14：86 PH=5.0)流速：1.0ml/min.。华法林对映体检测波长为308nm，进样量：20μl，数据处理：内标峰面积法定量计算。该方法符合生物样品分析要求。　　 结论：　　 ① CYP2C9基因型对华法林对映体的血浆浓度有影响，尤其是CYP2C9rs1057910位点的基因多态性与R(+)-华法林和S(-)-华法林血浆浓度都有相关性，携带CYP2C9rs1057910的C突变等位基因的患者对华法林代谢减慢，华法林血浆浓度较高，患者所需华法林维持剂量较少。　　 ② CYP3A4基因型对华法林对映体的血浆浓度无影响