姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们的重视，已成为肿瘤预防和治疗的一个研究热点。近年来，国内外的研究已使姜黄素的抗肿瘤作用初露端倪。研究表明，姜黄素可以抑制多种肿瘤细胞系的生长。但姜黄素抗肿瘤机制较为复杂，在不同的细胞类型中表现出不同的效应，诱导效应产生的分子机制也不尽相同。到目前为止，姜黄素抗肿瘤机制尚未为人们系统、明确地了解，还有待进一步的研究。　　 所以，我们以此立题，希望通过检测姜黄素给药后细胞凋亡、周期阻滞相关的基因和蛋白的变化来确定药物的作用靶点和通路。本研究中涉及到的方法主要有细胞培养、MTT法、RT-PCR、流式细胞术、Western Blot等。我们观察了姜黄素对乳腺癌细胞MCF-7生长的抑制作用，及其对细胞增殖周期各时相的影响。通过检测细胞凋亡的发生率，应用分子生物学手段分别从基因、蛋白和酶三个水平对姜黄素诱导MCF-7细胞凋亡及产生周期阻滞的分子作用机理进行探讨，验证姜黄素对MCF-7细胞凋亡、周期阻滞相关基因和蛋白表达的影响，明确药物作用的抗肿瘤分子通路，旨在为今后乳腺癌的治疗提供一定的理论依据。　　 1、姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞的生长抑制作用　　 采用MTT法和光镜观察研究姜黄素体外对乳腺癌细胞MCF-7的抑制作用，结果显示，姜黄素对体外培养人乳腺癌细胞MCF-7具有明显的增值抑制作用，并呈时间、剂量依赖关系；形态学观察结果显示，与空白对照组相比，姜黄素可显著抑制MCF-7细胞的生长，加药后细胞增殖减慢，变小，胞膜皱缩，漂浮，并且随着药物浓度的提高，细胞碎片逐渐增多。　　 2、姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡诱导作用　　 采用DAPI染色法、琼脂糖电泳法以及Annexin-V/PI双染流式细胞术观察姜黄素对MCF-7细胞凋亡的诱导作用，结果表明，姜黄素可诱导MCF-7细胞凋亡，出现明显的凋亡特征：核固缩、碎裂；琼脂糖电泳结果呈现明显的梯状条带：Annexin～V/PI双染流式细胞术检测结果显示15μM姜黄素作用24h、48h、72h后MCF-7细胞的凋亡率为12.58％、16.25％和25.61％。　　 3、姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡诱导作用的机理研究　　 3.1姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关基因Bax、Bcl-2的影响　　 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，15μM姜黄素作用24h、48h、72h后，RT-PCR检测。实验结果表明姜黄素能够影响人乳腺癌细胞MCF-7细胞凋亡相关基因bax和bcl-2 mRNA的表达。随着15μM姜黄素与人乳腺癌细胞MCF-7细胞共同孵育时间的延长，bcl-2基因的表达逐渐减少；而bax基因的表达呈上升趋势。姜黄素可以增强Bax基因mRNA表达、抑制bcl-2基因mRNA的表达。　　 3.2姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关蛋白的影响　　 3.2.1姜黄素对MCF-7细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的影响　　 体外培养人乳腺癌MCF-7细胞，15μM姜黄素作用24h、48h、72h后，收集细胞，采用western blots方法检测姜黄素对MCF-7细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。结果显示，姜黄素可明显促进Bax蛋白表达，降低Bcl-2蛋白的表达。　　 3.2.2姜黄素对MCF-7细胞中凋亡相关蛋白P53的影响　　 采用western blots方法检测姜黄素对凋亡相关基因P53蛋白表达的影响，结果表明，MCF-7细胞经姜黄素作用后，P53蛋白表达明显上调。　　 3.2.3姜黄素对MCF-7细胞中凋亡相关蛋白细胞色素c的影响　　 采用Western blots方法检测姜黄素对线粒体中细胞色素c蛋白含量的影响，结果表明，MCF-7细胞经姜黄素作用后线粒体中的细胞色素c蛋白含量明显下降，而胞浆中的蛋白含量上升。　　 3.3姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞caspase-3活性的影响　　 分别采用Western blots方法和caspase-3 assay kit研究姜黄素对MCF-7细胞caspase-3活性的影响。结果表明，姜黄素作用后，MCF-7细胞中caspase-3活性显著增强，并随姜黄素浓度增加而活性增强。　　 实验结论：结果表明，姜黄素对人乳腺癌MCF-7细胞的生长具有显著的抑制作用，并且能够诱导MCF-7细胞凋亡(apoptosis)，其作用机制可能是增加凋亡诱导基因p53蛋白的表达，后者通过调整bax和bcl-2基因的转录在增加Bax蛋白表达的同时减少Bcl-2蛋白的表达，进而使细胞色素c从线粒体释放入胞浆，激活caspase依赖的线粒体凋亡通路。