中国人类肝脏蛋白质组计划(CNHL2P，China Human Liver Proteome Project)是一项意义重大的全国性基础研究项目，湖北大学有幸参与其中。我们以430条全长肝脏ORF为诱饵，运用酵母双杂交技术对一个健康成人肝脏cDNA文库进行筛选，初筛得到了471个蛋白质相互作用对，通过共转化验证证实了224个，其中203个相互作用对未经报道过。在这203个蛋白质相互作用对中，与本研究室拥有的5000多条全长肝脏蛋白质ORF资源相对应的有107个，涉及132条全长ORF。本研究的目的是用免疫共沉淀和荧光共定位技术对这107个蛋白质相互作用对在哺乳动物细胞中作进一步验证，主要内容包括以下两个方面： (1) 将132条ORF克隆到免疫共沉淀载体上：将免疫共沉淀载体pMyc-kozak-gfp和pFlag-kozak-man改造为pMyc-kozak-gfp-BN和pFlag-kozak-gfp-BN，载体上的插入片段都替换为gfp，并在插入片段的上、下游各引入15bp的同源臂，使其与本研究室已经合成的用于酵母双杂交AD载体克隆的引物的同源臂保持一致，然后利用已有的引物将这些ORF克隆到免疫共沉淀载体上，成功克隆并测序验证110条ORF，对应于67个完整的蛋白质相互作用对。 (2) 荧光共定位载体的改造及部分ORF的克隆：在荧光共定位载体pDsRed1-N1和pEGFP-N1的多克隆位点插入填充片段ccdB,并在ccdB的上游引入kozak序列和XcmI识别位点，得到pKozak-ccdB-DsRed1 和 pKozak-ccdB-EGFP。pKozak-ccdB-DsRed1和pKozak-ccdB-EGFP对不携带F质粒的大肠杆菌宿主DH10B是致死的，可以消除克隆过程中污染的载体背景。现已成功克隆5条ORF，其中与EGFP融合的5个重组质粒在Hela细胞中均能正确表达，被转染细胞能激发绿色荧光，大规模克隆及融合质粒的功能验证工作正在进行中。