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研究背景微波(Microwave)是指频率在300 MHz～300 GHz的电磁辐射,主要由无线通信设备如手机、无线热点(Wireless Fidelity,Wi-Fi)及雷达等产生。据报道,5.8 GHz频段是既往较少被使用的公共无线频段,由于其带宽高、抗干扰性强,在不久将来有望代替目前正在使用的2.4 GHz无线技术。前不久,我国已将5.8 GHz频段作为点对点或点对多点扩频通信系统、高速无线局域网、宽带无线接入系统、蓝牙技术设备及车辆无线自动识别系统等无线电台站的共用频段。已有研究表明,大脑是电磁辐射的敏感器官,特定参数的电磁辐射暴露可导致人或动物神经行为的改变。迄今为止,关于5.8 GHz微波的生物学效应研究还较少,对神经行为尤其是对学习记忆能力的影响研究尚未见报道。因此,本研究以大鼠为实验对象,探讨了 5.8 GHz微波对动物学习记忆能力和海马突触可塑性的影响。研究目的探讨5.8 GHz微波不同时间暴露对大鼠学习记忆和海马突触可塑性的影响,为评价该频段微波对中枢神经系统的潜在健康危害及相关卫生标准的制定和修订提供理论和实验依据。第一部分5.8 GHz微波每天暴露1 h连续暴露15 d或30 d对大鼠学习记忆的影响材料与方法1.微波辐照源:5.8 GHz微波辐照系统主要由信号发生器、放大器和天线组成,可产生脉冲调制波,其输出功率可调。2.动物分组及暴露:健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠80只,体重(180±3)g,随机分为假暴露组(Sham,n=40)组和微波暴露组(Microwave,n=40)。动物每天接受微波全身暴露或假暴露1次,每次1 h,连续暴露15 d或30 d。动物暴露区域微波的功率密度(Power density,PD)为74.25 W/m2,全身比吸收率(Specific absorption rate,SAR)为 1.15 W/kg,头部 SAR 为 2.33 W/kg。假暴露组动物处理方式同暴露组,但控制系统关闭,无微波输出。3.实验方法:1)动物一般健康状况观察:检测微波单次暴露(1 h)前后大鼠肛温变化;实验期间定期监测大鼠体重;实验结束后检测大鼠血常规和肝肾功能等指标;2)采用莫里斯水迷宫实验(Morri s water maze,MWM)和新物体识别实验(Novel object recognition,NOR)检测大鼠学习记忆能力;3)采用 Hematein-Eosin(HE)染色和Nissl染色观察大鼠海马组织形态,采用酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中神经元特异性烯醇化酶(Neuron specific enolase,NSE)与 S100钙结合蛋白 B(S100 calcium binding protein B,S100B)含量以及大脑海马组织内炎性因子含量,以评价海马组织内神经元的损伤情况;4)采用Golgi染色观察大鼠大脑海马组织内树突棘密度,采用液相色谱-质谱联用仪(Liquid chromatography mass spectrometry,LC-MS)检测大鼠大脑海马组织内单胺类、氨基酸类、胆碱能类及其他类神经递质含量,采用Western blot(WB)检测大鼠海马组织内突触后致密物蛋白 95(Postsynaptic density protein 95,PSD95)、Synaptophysin等蛋白表达水平,以评价大鼠海马突触可塑性的变化。研究结果1.5.8 GHz微波暴露(1 h/d,15 d或30 d)对大鼠一般健康状况的影响1.1体温及体重检测结果显示:微波暴露或假暴露1h前后,各组大鼠肛温变化均不超过1℃,提示本实验条件下5.8 GHz微波暴露未产生热效应;实验期间各组大鼠一般状况良好,体重均随时间的延长而增长,与Sham组相比,Microwave 15 d组及Microwave 30 d组动物体重无明显变化(P>0.05)。1.2.血常规与肝肾功能检测结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组大鼠血常规指标(如:红细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、白细胞计数、淋巴细胞百分比、中性粒细胞百分比等)和肝肾功能指标(如:丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、血清肌酐含量等)与Sham组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。上述结果提示,本实验条件下,5.8 GHz微波暴露1 h/d,连续暴露15 d或30 d对大鼠一般健康状况无明显影响。2.5.8 GHz微波暴露(1 h/d,15 d或30 d)对大鼠学习记忆能力的影响2.1 MWM结果显示:微波暴露后,Microwave 15 d组及Microwave 30 d组大鼠在定向巡航阶段与空间探索阶段的逃逸潜伏期、穿越平台的次数、目标象限停留时间百分比及首次到达平台的潜伏期等指标与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠的空间学习记忆能力无明显影响。2.2 NOR结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组大鼠对新旧物体的探索时间、新物体探索时间的百分比及辨别指数等指标与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠的场景记忆能力无明显影响。3.5.8 GHz微波暴露(1 h/d,15 d或30 d)对大鼠大脑海马组织内神经元的影响3.1 HE染色结果显示:微波暴露15 d及30 d后,大鼠大脑海马组织形态无明显变化,细胞排列规则。Nissl染色结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组海马CAI区与DG区神经元数量与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠海马组织形态及神经元数量无明显影响。3.2 ELISA结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组大鼠血清脑损伤因子NSE与S100B、海马组织内促炎因子白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-Iβ)与肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、海马组织内抑炎因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)与转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)含量与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内神经元无明显损伤。4.5.8 GHz微波暴露(1 h/d,15 d或30 d)对大鼠大脑海马突触可塑性的影响4.1 Golgi染色结果显示:微波暴露后,Microwave 15 d组及Microwave 30 d组大鼠海马CA1区顶树突棘密度及基树突棘密度与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马CA1区树突棘密度无明显影响。4.2 LC-MS结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组海马组织内多种神经递质含量与Sham组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内神经递质含量无明显影响。4.3 WB结果显示:Microwave 15 d组及Microwave 30 d组海马组织内PSD95及Synaptophysin表达水平与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内突触蛋白表达无明显影响。上述结果提示,在本实验条件下,5.8 GHz微波暴露1 h/d,连续暴露15 d和30 d对大鼠学习记忆能力与海马突触可塑性无明显影响。第二部分5.8 GHz微波每天暴露2 h或4 h连续暴露15 d对大鼠学习记忆的影响材料与方法1.微波辐照源:同第一部分。2.动物分组及辐照:健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠75只,体重(258±5)g,随机分为假暴露组(Sham,n=25)、微波每天暴露2h组(Microwave 2 h,n=25)和微波每天暴露4 h组(Microwave 2 h,n=25)。各组连续暴露或假暴露15 d,动物暴露区域微波的PD为74.25 W/m2,全身SAR为1.15 W/kg,头部SAR为2.33 W/kg。假暴露组动物处理方式同暴露组,但控制系统关闭,无微波输出。3.实验方法:1)实验期间定期观察动物一般状况并定期监测大鼠体重,实验结束后检测大鼠血常规和肝肾功能等一般健康状况指标;2)利用MWM、NOR以及条件恐惧实验(Fear conditioning test,FCT)评估大鼠空间与非空间学习记忆能力;3)利用HE染色与Nissl染色观察海马组织内神经元形态及数量,利用ELISA检测大鼠血清脑损伤因子含量与海马组织内炎性因子含量,利用JC-1含量测定检测线粒体膜电位,利用透射电子显微镜观察神经元线粒体超微结构,以评估对大鼠大脑海马组织内神经元及神经元线粒体的影响;4)利用Golgi染色观察大脑海马组织内神经元树突棘密度,利用透射电子显微镜观察大脑海马组织内突触超微结构,利用LC-MS检测海马组织内神经递质含量、利用WB检测海马组织内PSD95、Synaptophysin、环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)含量,以评估微波对海马突触可塑性的影响。研究结果1.5.8 GHz微波暴露(2 h/d或4 h/d,15 d)对大鼠一般健康状况的影响1.1体重检测结果显示:实验期间各组大鼠一般状况良好,体重均随时间的延长而增长,与Sham组相比,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组动物体重均无显著变化(P>0.05)。1.2.血常规与肝肾功能检测结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠血常规指标(如:红细胞计数、血红蛋白含量、血小板计数、白细胞计数、淋巴细胞百分比与中性粒细胞百分比等)和肝肾功能指标(如:丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶与血清肌酐含量等)与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。上述结果提示,本实验条件下,5.8 GHz微波暴露2 h/d或4 h/d,连续暴露15 d对大鼠一般健康状况无明显影响。2.5.8 GHz微波暴露(2 h/d或4 h/d,15 d)对大鼠学习记忆能力的影响2.1 MWM结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠的逃逸潜伏期、穿越平台的次数、目标象限停留时间百分比及首次到达平台的潜伏期等指标与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠的空间学习记忆能力无明显影响。2.2 NOR结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠对新旧物体的探索时间与新物体探索时间的百分比及辨别指数等指标与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠的场景记忆能力无明显影响。2.3 FCT结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠的场景性僵直时间百分比和声音相关僵直时间百分比等指标与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠的情绪记忆能力无明显影响。3.5.8 GHz微波暴露(2 h/d或4 h/d,15 d)对大鼠海马组织内神经元的影响3.1 HE染色结果显示,微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠大脑海马组织形态无明显变化,细胞排列规则。Nissl染色结果显示,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠大脑海马CA1区与DG区神经元数量与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织形态及神经元数量无明显影响。3.2 ELISA结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠血清NSE、血清S100B含量与大脑海马组织内炎性因子含量与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内神经元无明显损伤。3.3线粒体膜电位检测结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠大脑海马组织内神经元线粒体JC-1单体含量与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内神经元线粒体功能无明显影响。3.4透射电子显微镜结果显示:微波暴露15 d后,各组大鼠大脑海马组织内神经元线粒体脊清晰,膜连续完整,线粒体无明显肿胀,提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对海马组织内神经元线粒体结构无明显影响。4.5.8 GHz微波暴露(2 h/d或4 h/d,15 d)对大鼠大脑海马突触可塑性的影响4.1 Golgi染色结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠CA1区树突棘密度与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马CA1区树突棘密度无明显影响。4.2透射电子显微镜结果显示:微波暴露15 d后,大鼠大脑海马组织内神经元之间的突触前后膜清晰完整,突触小泡大小均匀并大量聚集于突触前终末内,各组均未观察到明显的突触解体。Microwave 2 h组及Microwave 4 h组的突触直径、突触小泡数量、突触间隙宽度、突触后致密物面积与Sham组相比,差异无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内突触结构无明显影响。4.3 LC-MS结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠大脑海马组织内多种神经递质含量与Sham组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内神经递质含量无明显影响。4.4 WB结果显示:微波暴露15 d后,Microwave 2 h组及Microwave 4 h组大鼠大脑海马组织内PSD95、Synaptophysin以及CREB含量与Sham组相比,差异均无统计学意义(P>0.05),提示本实验条件下,5.8 GHz微波暴露对大鼠大脑海马组织内突触可塑性相关蛋白表达无明显影响。上述结果提示,在本实验条件下,5.8 GHz微波暴露2 h/d或4 h/d,连续暴露15 d对大鼠学习记忆能力与海马突触可塑性无明显影响。研究结论1.本实验条件下,5.8 GHz微波每天暴露1 h,连续暴露15 d或30 d,对大鼠一般健康状况、学习记忆能力及海马突触可塑性无明显影响。2.本实验条件下,5.8 GHz微波每天暴露2h或4 h,连续暴露15 d,对大鼠一般健康状况、学习记忆能力及海马突触可塑性无明显影响。上述结果为科学评价5.8 GHz微波暴露的潜在健康危害和相关卫生标准的制定和修订提供了理论和实验依据,同时也为5.8 GHz无线技术的应用推广提供了生物安全证据。