新型鸭肝炎病毒生物学特性及病毒样颗粒表达载体的构建

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鸭病毒性肝炎(Duck viral hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(DVH virus,DVHV)引起的一种以肝脏病变为主要特征的高度致死性传染病,临床主要表现为角弓反张,剖检可见肝脏肿大和出血性斑点。20世纪以来,该病已成为危害雏鸭最为严重的传染病之一,给我国的养鸭业带来了巨大的经济损失。目前,我国流行的鸭肝炎病毒主要为Ⅰ型鸭肝炎病毒,但是从90年代开始我国陆续发现了新型鸭肝炎病毒(其血清型与基因型均与Ⅰ型鸭肝炎病毒的有较大差异),而对新型鸭肝炎病毒引起的雏鸭病毒性肝炎的研究较少,因此本试验对实验室分离保存的一株新型鸭肝炎病毒进行生物学特性的测定,并在此基础上利用杆状病毒表达系统成功构建了病毒样颗粒表达粒载体。   本研究将新型鸭肝炎病毒QY3株按照常规方法接种9~11日龄鸭胚,可见大部分鸭胚胚体出血;病毒的毒力测定结果表明,该毒株的鸭胚半数致死量ELD50为10-3.625/0.2mL,雏鸭半数致死量LD50为10-3.714/0.5mL;理化特性研究发现,该毒株经乙醚和氯仿作用后病毒的ELD50基本保持不变,说明该毒株对脂溶剂不敏感,该毒株经胰蛋白酶作用后ELD50未发生明显的变化,说明该毒株对胰蛋白酶不敏感,耐酸性试验可知此毒株能够耐酸(pH3.0),且病毒在56℃作用1h可完全灭活;选择5日龄非免疫雏鸭经滴鼻方式攻毒后,雏鸭在24h即出现精神沉郁、不愿走动等临床症状,并在出现临床症状后几小时内死亡,多数病鸭剖检后,肉眼可见肝脏、肾脏和脾脏肿大,充血,脑呈树枝状充血,将病变明显的脏器进行病理组织学观察,可见肝细胞严重坏死,中央静脉淤血,脾细胞和肾细胞有轻微的变性,并伴有充血,脑细胞变性、水肿;应用Ⅰ型鸭肝炎病毒SS株和新型鸭肝炎病毒QY3株制备高免血清进行交叉中和实验,结果表明SS株和QY3株之间的相关系数为0,即无血清相关性,本研究为该病的防治提供理论基础和实验依据。   同时,根据GenBank上已发表的新型鸭肝炎病毒基因序列设计了三对特异性引物,以QY3株为模板,采用RT-PCR方法成功扩增了QY3株P12A、3C、BAC1-3C基因,将其分别克隆到pJET1.2载体上,转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,经SalⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/KpnⅠ、SmaⅠ/KpnⅠ的双酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性重组质粒并送测序,随后重组阳性质粒分别亚克隆到pFastBac TM1和pFastBacTMDual载体上,然后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞,经SalⅠ/HindⅢ、EcoRⅠ/KpnⅠ、SmaⅠ/KpnⅠ的双酶切鉴定和PCR鉴定,筛选出阳性重组转移载体并送测序,随后将阳性的重组转移载体分别转化至DH10Bac感受态细胞中,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定,获得重组穿梭载体rBacmid-P12A,rBacmid-3C,rBacmid-P12A-3C,病毒样颗粒表达载体的构建为新型鸭肝炎疫苗的研究奠定了基础。
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