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副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)病是当今危害养猪业的一种重要的细菌性传染病之一,又称为革拉瑟病(Gl(a)ssers)。该病主要以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎为特征,可造成养猪业严重的经济损失。本研究对我国华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性及分子流行病学进行研究,为副猪嗜血杆菌的耐药机制的研究及我国华南地区对于该病的诊断、预防与控制提供科学依据。
本研究针对2008年-2010年自我国华南地区猪场的病料中分离鉴定的115株副猪嗜血杆菌进行耐药性的调查研究。结果表明115株副猪嗜血杆菌对左氧氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星等喹诺酮类药物的耐药率为26.09％-70.43%,有6.96%-26.09%的分离菌株对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、头孢唑啉、头孢克洛、头孢噻肟等β-内酰胺类药物耐药,16.52%-25.22%的菌株对四环素和多西环素耐药,115株分离菌株对磺胺甲恶唑和TMP的耐药率高达91.30%,对庆大霉素和红霉素耐药率分别为40.87%和46.96%,另外还有19.13%的菌株对氯霉素耐药。本研究发现不同区域的菌株对抗菌药的耐药性有一定的差异。2008年-2010年华南地区副猪嗜血杆菌的耐药性总体上呈现逐年上升的趋势。从115株副猪嗜血杆菌的多重耐药(包括耐不同种类的药物,以及耐同类药物中的不同药物)研究,可以看出被检测菌株主要以7重(19.13%)、8重(17.39%)耐药为主,其次是9重(12.17%)、5重(9.57%)和6重(9.57%)耐药。另外还有9.57%的菌株为13重以上耐药,而这些菌株主要见于2010年的分离株。
采用PCR方法对质粒介导的喹诺酮耐药基因(PMQR)进行检测。并且以15株对喹诺酮类药物比较敏感的标准菌株为参照,选取20株对喹诺酮类药物耐药性比较的高的副猪嗜血杆菌,研究其喹诺酮耐药决定区(QRDRs)(gyrA,gyrB,parC,parE)的氨基酸突变位点。从115株临床分离株中检测到PMQR阳性菌株6株(5.22%),qnrA、qnrB和aac(6)-Ib-cr-分别为3株(2.61%)、1株(0.87%)和3株(2.61%),其中一株同时携带qnrA和aac(6)Ib-cr。通过QRDRs(gyrA、gyrB、parC,parE)氨基酸比较发现:与15株标准菌株相比,20株耐药菌株中100%的菌株至少有一个gyrA突变位点(S83Y、S83F、D87Y、D87N、D87G),90%的菌株有两个gyrA突变位点;而gyrB没有发现突变位点。ParC突变位点有Y577C、V648I、E678D、S669F、A464V、A466S,而这些突变位点有的也存在于15株标准菌株中。ParE的突变位点有S283G、A227T和G241S,这些突变位点主要存在于qnr阳性菌株中。QRDRs的研究表明DNA促旋酶(gyrA)可能与副猪嗜血杆菌的喹诺酮耐药性有密切的关系,而parC和parE的突变位点与耐药性的关系有待于进一步的研究。本研究发现副猪嗜血杆菌对喹诺酮类药物产生耐药性是由质粒介导的耐药基因的散播和喹诺酮耐药决定区的氨基酸多位点的突变共同作用的结果。
采用PCR和多重PCR方法对β-内酰胺类、四环素类、磺胺类、大环内酯类、氨基糖苷类、氯霉素类耐药基因和整合子进行检测。PCR扩增结果显示:携带blαTEM型β-内酰胺酶的菌株有15株(13.04%),其中blαTEM-1占5株(4.35%),blαTEM-116占10株(8.70%);携带blαROB-1型β-内酰胺酶的菌株有5株(4.35%);携带tetB基因的菌株有18株(15.65%);携带sul基因的菌株有13株(11.30%),其中sull占3株(2.61%),sul2占10株(8.70%);携带大环内酯类耐药基因的菌株有9株(7.83%),其中ermB占7株(6.09%),mefA占3株(2.61%)。另外,还在一株副猪嗜血杆菌中发现Ⅰ类整合酶基因,基因盒的基因为aadA2—编码氨基糖苷类抗性基因。
采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型方法来初步探讨副猪嗜血杆菌耐药基因的传播规律。PFGE分子分型结果表明,携带耐药基因的副猪嗜血杆菌都可以成功分型,大多数携带耐药基因的副猪嗜血杆菌的PFGE图谱呈现多样性的特点,说明大多数携带耐药基因的部分副猪嗜血杆菌呈现明显的遗传差异性;而部分菌株的PFGE图谱完全一致,说明存在散发的克隆传播。