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目的: 1.调查温州地区婴幼儿巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)感染流行株的gB、gN基因型分布情况,探讨婴幼儿HCMV感染相关疾病与gB、gN基因型的关系。 2.建立一种简便、快速检测HCMV gB基因型的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法。 方法: 1.收集HCMV活动性感染患儿标本187例,采用微粒子酶免分析法检测血清HCMV IgM/IgG抗体、实时荧光定量PCR法检测尿液HCMV DNA载量、间接免疫荧光法检测外周血HCMV pp65抗原;采用聚合酶链反应结合限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测HCMV gB基因型与HCMV gN基因型,并通过基因测序进行验证;分析HCMV gB、gN基因型与婴幼儿HCMV感染相关疾病的关系。 2.设计针对HCMV gB1~4不同基因型的特异性引物,建立检测HCMV gB基因型的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法,并与PCR-RFLP法检测结果进行比较。 结果: 1.HCMV活动性感染患儿各项指标检测结果:187例患儿中17例血清HCMVIgM+/IgG-占9.09%(17/187),50例血清HCMV IgM-/IgG+占26.74%(50/187),120例血清HCMV IgM+/IgG+占64.17%(120/187);外周血HCMV pp65抗原阳性率占63.10%(118/187);所有患儿尿液HCMV DNA均为阳性,HCMV DNA载量对数均值为5.67±1.11。 2.HCMV gB基因型检测结果:187例HCMV感染流行株存在gB1~3型,其中gB1型占51.87%(97/187),gB2型占20.86%(39/187),gB3型占18.18%(34/187),gB混合型占9.09%(17/187),gB混合型中gB1+3混合型16例,gB1+2混合型1例。gB混合型患儿尿液HCMV DNA载量比单一gB基因型患儿高,差异具有统计学意义(t=2.018,p=0.045),单一gB基因型患儿间尿液HCMV DNA载量差异无统计学意义(F=1.082,p=0.341)。90例HCMV肝炎患儿中gB1型占67.78%(61/90),gB2型占11.11%(10/90),gB3型占13.33%(12/90),gB混合型占7.78%(7/90)。gB混合型与单一gB基因型患儿ALT、AST生化指标差异无统计学意义(Z=0.723,p=0.469; Z=0.942,p=0.346);单一gB基因型患儿间ALT、AST生化指标差异无统计学意义(H=3.103,p=0.212; H=3.937,p=0.14)。43例HCMV肺炎患儿中gB1型占37.21%(16/43),gB2型占27.91%(12/43),gB3型占23.25%(10/43),gB混合型占11.63%(5/43)。28例HCMV全身性感染患儿中gB1型占42.86%(12/28),gB2型占25.00%(7/28),gB3型占17.86%(5/28),gB混合型占14.28%(4/28)。HCMV肝炎、HCMV肺炎、HCMV全身性感染患儿间HCMV gB基因型分布差异有统计学意义(x2=14.15,p=0.027);HCMV肝炎与HCMV肺炎患儿的HCMV gB基因型分布差异有统计学意义(x2=11.87,p=0.008);HCMV肝炎与HCMV全身性感染患儿的HCMV gB基因型分布差异无统计学意义(x2=6.28,p=0.098);HCMV肺炎与HCMV全身性感染患儿的HCMV gB基因型分布差异无统计学意义(x2=0.519,p=0.914)。 3.HCMV gN基因型检测结果:132例HCMV感染流行株存在gN1~4型,其中gN1型占10.61%(14/132),gN2型占9.09%(12/132),gN3型占25.76%(34/132),gN4型占54.54%(72/132);4型间尿液HCMV DNA载量差异无统计学意义(F=0.599,p=0.617)。65例HCMV肝炎患儿中gN1型占10.77%(7/65),gN2型占7.69%(5/65),gN3型占23.08%(15/65),gN4型占58.46%(38/65);4型间的ALT、AST生化指标差异无统计学意义(H=1.245,p=0.742; H=2.073,p=0.557)。35例HCMV肺炎患儿中gN1型占14.28%(5/35),gN2型占11.43%(4/35),gN3型占25.71%(9/35),gN4型占48.57%(17/35)。17例HCMV全身性感染患儿中gN1型占5.89%(1/17),gN2型占11.76%(2/17),gN3型占29.41%(5/17),gN4型占52.94%(9/17)。HCMV肝炎、HCMV肺炎、HCMV全身性感染患儿间HCMV gN基因型分布差异无统计学意义(x2=1.85,p=0.932)。 4.HCMV gB基因型SYBR GreenⅠ实时荧光PCR检测方法的建立:SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法通过熔解曲线分析来区分各gB基因型,各gB基因型均有其特异性熔解曲线和Tm值,其中gB1型Tm值为81.5±0.55℃,gB2型Tm值为77.8±0.49℃,gB3型Tm值在79.9±0.52℃;SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法与PCR-RFLP法检测HCMV gB基因型结果一致(Kappa=0.975)。 结论: 1.温州地区HCMV感染流行株gB基因型存在gB1~3型,以gB1型为主,尚未发现gB4型;gN基因型存在gN1~4型,以gN4型为主。 2.本研究表明HCMV gB混合型感染尿液HCMV DNA载量高于单一gB基因型感染,提示HCMVgB混合型感染可能更具病毒复制性。HCMV gB基因型在HCMV肝炎中以HCMV gB1型为主。HCMV gN基因型在HCMV肝炎、HCMV肺炎、HCMV全身性感染疾病中以HCMV gN4型为主。 3.本研究建立的SYBR GreenⅠ实时荧光PCR方法是一种操作简便、特异性强、敏感度高、结果稳定、能快速检测HCMV gB基因型的技术。