论文部分内容阅读
目的:缺血后处理(ischemic post-conditioning,IPO)能够激发机体内源性保护作用,减轻缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)后的炎症反应,但具体作用机制目前尚不明确。本课题旨在探讨IPO对局灶性脑缺血再灌注大鼠Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)-Toll/IL-1受体结构域接头分子(Toll-interleukin 1 receptor domain-containing adapter-inducing interferon-b,TRIF)信号转导途径的影响,进一步阐述IPO的神经保护机制,为临床应用IPO治疗缺血性卒中提供理论依据。方法:研究选用130只成年健康雄性Sprague-Dawley大鼠并随机分为假手术组(sham组)30只,模型组和干预组各50只,sham组根据手术后,模型组和干预组根据再灌注后时间点随机分为6h、12h、24h、48h和72h 5个亚组,sham组每个亚组各6只,模型组和干预组每个亚组各10只。后两组采用Zea-longa线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。sham组仅手术暴露颈总动脉及分叉处,不阻断大脑中动脉。在再灌注开始时即模型建立后2h对干预组大鼠进行IPO处理(即术后2 h将栓线拔出至头部位于颈总动脉分叉处,10s后再将栓线置入初始位置10s,如此重复6次)。对模型组大鼠仅拔出栓线,不给予IPO处理。于再灌注后6h、12h、24h、48h、72h等时间点,采用Menzies法进行神经功能缺损评分;2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色观察脑梗死体积;原位末端标记法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)法检测缺血侧脑组织细胞凋亡;实时定量荧光PCR(Real-time quantitative PCR,qPCR)检测大鼠缺血侧颞、顶叶皮质TLT4-TRIF信号转导途径的特异性结构分子及关键细胞因子TLR4、TRIF、TRIF相关的接头分子(TRIF-related adaptor molecule,TRAM)、干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3,IRF-3)及β干扰素(interferon-β,INF-β)等的m RNA表达;免疫组织化学(immunohistochemistry)检测大鼠缺血侧脑组织中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等结构分子及关键细胞因子蛋白阳性细胞的分布与表达;免疫印迹法(western blotting)定量检测大鼠缺血侧颞、顶叶皮质中TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β等结构分子及关键细胞因子的蛋白表达。结果:模型组、干预组大鼠都出现不同程度的神经功能缺损及缺血侧大脑半球梗死。相比模型组,干预组大鼠神经功能缺损评分得到显著改善(t=2.963~5.262,P<0.05),脑梗死体积明显减少(t=3.341~3.875,P<0.05),凋亡细胞计数明显减少(t=2.332~3.643,P<0.05)。模型组和干预组TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-βm RNA和蛋白表达于再灌注6h时已显著升高。qPCR结果显示干预组TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-βm RNA表达较模型组各对应时间点显著降低(t=2.240~6.587,P<0.05),免疫组织化学检测结果显示TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白阳性细胞主要位于缺血侧额、颞叶皮质,干预组阳性细胞计数较模型组各对应时间点显著降低(t=2.256~8.180,P<0.05)。Western blotting检测结果显示干预组TLR4、TRIF、TRAM、IRF-3及IFN-β蛋白表达较模型组各对应时间点显著降低(t=2.943~8.227,P<0.05)。结论:本研究证实IPO能够通过抑制细胞凋亡、减少脑梗死体积发挥神经保护作用,改善MCAO大鼠的神经功能。IPO还可能通过抑制TLR4-TRIF信号转导途径减少通路下游IRF-3、IFN-β等炎症相关因子的表达,减轻I/R后的局灶性炎症反应,进而激发内源性神经保护作用。