论文部分内容阅读
目的肾小管上皮-肌成纤维细胞转分化(epithelial-myofibroblast transition,EMT)是肾小管间质纤维化(renal interstitial fibrosis,RIF)形成的重要原因之一,与肾功能进展密切相关。白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)作为重要的致炎因子,可通过激活IL-1/IL-1受体(IL-1R)/NF-κB信号通路,参与EMT的发生。Toll样受体/白介素-1受体8(Toll-like receptor/IL-1R 8,TIR8)是TLR/IL-1R超家族的成员,被认为是IL-1R/NF-κB信号的负调控因子,在抑制肾内炎症及肾组织重塑中发挥着重要作用。然而,在IL-1β诱导EMT发生进而促进RIF的过程中,TIR8的作用及其调控机制知之甚少。所以,本研究探讨TIR8在IL-1β诱导的EMT发生中的作用及其分子机制,并为临床干预RIF的发生提供理论依据。方法1.细胞水平的研究(1)为了研究炎症因子IL-1β是否通过活化NF-κB进而调控TIR8的表达,以人的肾小管上皮细胞(human renal tubular epithelial cells,HKC)作为研究的细胞模型,利用重组人IL-1β(10 ng/ml)及NF-κB活化的抑制剂(10μM BAY 11-7082)处理细胞,通过Western blot(WB)检测TIR8,NF-κB(p65)及其活化的NF-κB(p-p65)的变化;(2)为了研究TIR8对IL-1β活化的NF-κB是否具有负调控作用,分别利用稳定干涉绿色荧光蛋白基因的HKC对照株(HKC/Sc)以及稳定干涉TIR8基因的HKC细胞株(HKC/shTIR8)、瞬时转染绿色荧光蛋白的HKC对照株(HKC/vector)及瞬时转染过表达TIR8质粒的HKC细胞株(HKC/TIR8),WB方法检测HKC细胞中TIR8的表达变化对NF-κB活化的影响。(3)为了研究TIR8在IL-1β诱导的EMT发生中的作用,利用IL-1β处理HKC/shSC及HKC/shTIR8细胞,光学显微镜记录各组细胞形态变化,并对上述细胞进行划痕实验以及Transwell实验,从而探究TIR8对HKC迁移能力的影响;利用WB以及免疫荧光(Immunofluorescence,IF)检测与EMT发生相关的标记分子,如:转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1),E-钙黏蛋白(E-cadherin),波形蛋白(Vimentin)等。2.动物模型的研究:(1)为了进一步验证肾间质纤维化是否涉及TIR8/NF-κB反馈调控机制,以及该机制是否与IL-1β诱导的EMT发生有关,我们利用单侧输尿管结扎术(unilateral ureteric obstruction,UUO)构建SD大鼠RIF模型;生物化学方法检测各组大鼠肾功能改变;HE染色及Masson染色分别检测各组大鼠肾脏病理损伤程度以及肾间质纤维化程度;(2)免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)检测肾组织中IL-1β、TIR8、p-p65水平变化以及与EMT相关的标记分子表达情况。结果1.TIR8通过反馈调控IL-1β诱导的HKC细胞中NF-κB的活化参与EMT发生。(1)随着IL-1β处理时间的延长,HKC细胞内p-p65水平在15 min时出现短暂的高峰,随后逐渐减少,12 h后基本接近初始水平,而TIR8表达水平随刺激时间的延长逐渐增加,于6 h增加趋势最明显,6 h后仍略有增加;与DMSO对照组相比,BAY 11-7082处理的HKC细胞组中,其TIR8表达水平明显降低;(2)较HKC及HKC/shSc对照组而言,WB显示HKC/shTIR8细胞无论有无IL-1β处理,其p-p65水平均显著增加;与HKC及HKC/vectorc对照组相比,HKC/TIR8细胞中p-p65水平明显降低;(3)与HKC/shSc细胞相比,HKC/shTIR8细胞在IL-lβ处理48 h后,丧失其鹅卵石形态,呈长梭状改变;WB和IF均显示,HKC/shTIR8细胞在IL-lβ处理后,与EMT相关的标志分子E-cadherin明显降低,而间质标志物Vimentin明显增加;无论有无IL-1β刺激,HKC/shTIR8细胞内TGF-β1的水平较HKC细胞均增高;划痕实验以及Transwell实验表明在IL-1β刺激下,HKC/shTIR8细胞更容易发生迁移与侵袭;2.肾纤维化动物模型进一步证实,IL-1β激活NF-κB并促进EMT的发生与肾小管上皮TIR8的表达水平降低有关。(1)相对于空白对照组(Control)及假手术组(Sham),UUO组血清尿素、24h尿肌酐以及24 h尿素氮水平显著增加;肉眼可见UUO组大鼠梗阻侧肾脏内部含大量积液,液体呈黄褐色浑浊样,出现肾实质变薄以及肾盂积水现象;HE染色发现,较Control组和Sham组而言,UUO组梗阻侧肾脏出现肾小管上皮细胞变性坏死、管腔萎缩或扩张、炎性细胞浸润等形式的肾脏损伤;Masson三色染色显示梗阻侧肾脏胶原基质沉积明显,出现大面积的纤维化;(2)相对于Control组和Sham组,IHC检测分析显示UUO组梗阻侧肾小管上皮细胞IL-1β和p-p65呈高水平改变,而TIR8表达水平下降;IHC显示梗阻侧肾小管上皮细胞E-cadherin水平降低,TGF-β1以及Vimentin水平增加。结论1.IL-1β通过活化NF-κB进而促进HKC细胞中TIR8表达;TIR8可反馈抑制IL-1β诱导的NF-κB活化;2.肾小管上皮细胞中TIR8表达缺失有利于IL-1β诱导的肾小管上皮细胞发生EMT;3.TIR8可作为防治RIF潜在靶点。