论文部分内容阅读
Ras超家族是一类重要的功能蛋白,可介导生长因子、细胞因子和多种细胞外信号的信息通路,对细胞生长、分化、存活、增殖等多种功能的调节发挥重要作用。通过NCBI数据库分析,发现家蚕中有Ras超家族的成员ras oncogene(Bras2)基因,并将其命名为BmBras2。BmBras2基因的cDNA序列全长为1,412 bp,开放阅读框(ORF)为603 bp,编码200个氨基酸残基,预测该蛋白的分子量为22.9 kD,等电点(pI)为6.62。BmBras2基因的Genebank登陆号为AB206960。通过PCR的方法扩增BmBras2基因的ORF并插入到载体pET-28a(+)的EcoRⅠ和HindⅢ位点,构建重组表达质粒pET-28a(+)-BmBras2,转化大肠杆菌Rosetta(DE3)。筛选阳性克隆后,经IPTG诱导,带有His标签的重组蛋白rBmBras2得以成功表达。表达的rBmBras2蛋白经过镍柱亲和纯化后,以纯化的重组蛋白为抗原,免疫雄性新西兰大白兔获得该蛋白的多克隆抗体。经ELISA检测,抗体效价可达1:12,800以上,Western blot检测抗体的特异性良好,说明该多克隆抗体符合进一步实验的要求。我们对BmBras2基因在蛋白表达和基因转录两个水平进行了表达分析,Western blot和荧光定量PCR的结果说明BmBras2在四个发育时期都有表达,在蛹中的表达量最高,在五龄幼虫、蛾和卵中的表达量相对较低;在家蚕的八个组织中也都有表达,在头、肠和表皮中的表达量相对较高。用免疫荧光技术对目的蛋白进行亚细胞定位,发现BmBras2蛋白主要定位在Bm5(家蚕卵巢上皮细胞)的细胞核中,部分定位于细胞质中而不存在于膜上。相关的细胞增殖实验,显示rBmBras2能促进肝癌细胞PLC及HepG2的增殖而不能促进正常肝细胞L02的增殖。该结果为进一步研究BmBras2蛋白的相关功能奠定了一定的基础。