目的：视神经损伤是临床常见的眼外伤类型，可以导致严重的视力障碍甚至视力完全丧失，是眼科领域亟待解决的难题。既往认为视神经损伤后无再生能力，而近年来研究显示，约有50%视神经损伤患者能不同程度的恢复视力，表明视神经损伤后在一定条件下可以再生。因此，寻找一种安全有效的药物以延缓视神经损害病变的发展迫在眉睫。米诺环素是一种第二代半合成四环素类抗生素，近年研究显示，米诺环素(Minocycline，MC)对受损的神经元有相当强的保护作用。人们对中枢神经系统的研究发现，其在神经系统的变性等疾病中具有抗炎、抗凋亡等作用，能够通过抑制小胶质细胞及前凋亡因子，拮抗谷氨酸的神经毒性作用，从而提高神经元的生存率，发挥神经元保护作用。动物模型研究表明，米诺环素在脑中可达50%的血药峰浓度，因此在许多神经系统疾病，如脑缺血、脑外伤、萎缩性脊髓侧索硬化、亨廷顿病等中枢神经系统疾病和体外培养视网膜疾病动模型中均显示有一定的神经元保护作用。而且经实践证明，长期口服米诺环素无明显不良反应、安全有效。虽然米诺环素用在中枢神经保护方面的研究日渐增加，但在视神经损伤后，米诺环素能否发挥一定的神经保护作用及作用机制尚不清楚，且在眼科视神经保护方面的报道少见。本实验通过采用视神经夹伤模型建立大鼠视神经损伤模型，并加以腹腔注射一定剂量的米诺环素进行干预，应用计算机图像分析技术和免疫组化技术对视网膜神经节细胞和胶质源性神经营养因子（Glial cellline-derived neurotrophic factor,GDNF）及血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor,VEGF）的表达进行半定量测定，探讨米诺环素对视网膜神经节细胞的保护作用，从而为临床治疗视神经损伤提供实验依据。方法：选用健康清洁级雄性SD大鼠50只（由河北医科大学实验动物研究中心提供），体质量（200±20）g，适应性喂养5d后查双眼,屈光间质清，瞳孔等大、等圆，对光反射灵敏，眼底无异常者入组，随机分为三组：空白对照组10只，生理盐水对照组20只，米诺环素治疗组20只。两实验组均采用视神经钳夹法将左眼制成视神经损伤模型，右眼为自身对照眼，之后行直接检眼镜检查，眼底红光反射正常，无缺血，无眼球突出，眼睑闭合完全者为成功模型，右眼不予处理。实验动物10%水合氯醛(35mg／kg)腹腔注射麻醉并经常规无菌处理后，沿角巩膜缘环形剪开颞侧球结膜，钝性分离暴露视神经眶内段，用标定力量的反向镊于球后2mm处钳夹视神经，致伤时间为20s，用l0-0尼龙线缝合球结膜2针，结膜囊内涂氧氟沙星眼膏。米诺环素组、生理盐水组于视神经夹伤前1h及夹伤后每天腹腔分别注射米诺环素45mg/kg、等容量生理盐水，空白对照组无特殊处理。分别于伤后1天、3天、7天、14天、28天多聚甲醛心脏灌注处死大鼠，立即摘除左眼眼球,锯齿缘后0.5mm处剪开眼球壁,去除眼前节和玻璃体。用体积分数为4%的多聚甲醛进行固定，4℃冰箱过夜，眼杯行全层石蜡包埋，制备5~7μm视网膜切片，显微镜观察并同步采集图像。常规HE染色观察视网膜形态学变化，并应用图像分析系统(×400)对结果进行分析(每张切片取4个视野，在距离视乳头中心1.5mm处视网膜为观察始点分别向四面各取1个视野，每个眼球取2张切片)。GDNF的检测采用免疫组化半定量的方法，计算机图像分析，并用多功能真彩色细胞图像分析管理系统对视网膜中阳性反应部位进行分析，得出平均光密度值。应用SPSS13.0统计软件，平均光密度值及平均阳性细胞数结果均以x|-±s表示，同一组内不同时间点数据进行单因素方差分析(One-wayANOVA)，不同组间同一时间点数据进行两样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义，P<0.01为差异有显著统计学意义。结果：1视网膜神经节细胞苏木精-伊红染色结果：1.1视网膜神经节细胞形态学改变：空白对照组大鼠视网膜大致呈3层平行排列,分为神经节细胞层、双极细胞层及感光细胞层，视网膜节细胞位于视网膜内层,单层排列,细胞比较致密,细胞核排列均匀整齐。生理盐水对照组可见随着损伤时间延长，大鼠视网膜神经节细胞层胞核排列明显紊乱，空泡化程度增强，双极细胞层胞核数量也不同程度减少。比较而言，相同时间点米诺环素治疗组大鼠视网膜神经节细胞排列相对整齐，空泡化程度相对较弱，双极细胞层饱和数量相对较多。1.2视网膜神经节细胞数量改变：正常对照组视网膜神经节细胞计数为29.9±0.10。生理盐水对照组大鼠1天、3天、7天、14天、28天光镜下每×400视野平均视网膜神经节细胞数目分别为：23.6±2.07个、18.2±0.84个、12.2±1.30个、7.4±2.19个、3.6±1.51个，米诺环素治疗组大鼠1天、3天、7天、14天、28天光镜下每×400视野平均视网膜神经节细胞数目分别为：26.4±2.07个、21.8±2.59个、15.4±1.14个、11.8±1.64个、7.6±1.81个，相同时间点治疗组视网膜神经节细胞数量均高于对照组，3天时间点视网膜神经节细胞计数差异有统计学意义（P <0.05），7天、14天、28天时间点视网膜神经节细胞计数差异有显著统计学意义（P <0.01）。2视网膜GDNF和VEGF免疫组化半定量检测结果：2.1GDNF在视网膜中的表达：大鼠视网膜中GDNF主要在各层细胞胞体表达，呈棕黄色，正常对照组视网膜组织中GDNF弱阳性表达，平均光密度值为0.1543±0.0060，各时间点无变化。生理盐水对照组视网膜神经节细胞层GDNF表达平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分别为:0.2323±0.0024、0.2804±0.0040、0.2962±0.0022、0.3401±0.0021、0.2830±0.0027，米诺环素治疗组视网膜神经节细胞层GDNF表达平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分别为:0.2348±0.0036、0.2870±0.0041、0.3016±0.0022、0.3506±0.0060、0.2882±0.0023，视神经夹伤后两实验组均有GDNF阳性表达,生理盐水对照组表现为弱阳性;米诺环素治疗组GDNF表达呈上升趋势,14天后表达呈强阳性;生理盐水对照组表达也随时间有所增强,但14天时表达较治疗组仍不明显;相同时间点治疗组GDNF阳性率均高于对照组,差异均有统计学意义（P <0.05）。2.2VEGF在视网膜中的表达：大鼠视网膜中VEGF主要在各层细胞胞体、胞浆表达，呈棕黄色。正常对照组视网膜组织中VEGF弱阳性表达，平均光密度值为0.1598±0.0055，各时间点无变化。生理盐水对照组视网膜神经节细胞层VEGF表达平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分别为:0.2266±0.0013，0.2276±0.0011，0.2909±0.0044，0.3209±0.0033，0.3427±0.0011；米诺环素治疗组视网膜神经节细胞层VEGF表达的平均光密度值1天、3天、7天、14天、28天的值分别为:0.2271±0.0017，0.2287±0.0007，0.3090±0.0105，0.3256±0.0021，0.3488±0.0010。米诺环素治疗组及生理盐水对照组VEGF表达均呈上升趋势，第1、3、7天时间点生理盐水对照组较米诺环素治疗组平均光密度值数值比较无统计学意义（P>0.05），从第14天开始米诺环素治疗组VEGF表达的平均光密度值较生理盐水对照组高，差异有统计学意义（P<0.05），28天时间点时，血管内皮生长因子表达的平均光密度值较生理盐水对照组高，差异有显著统计学意义（P<0.01）。结论：1米诺环素可减少视神经损伤后视网膜神经节细胞的凋亡，对视神经有保护作用。2米诺环素能增强视神经损伤后早期视网膜胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)的表达，对损伤后视网膜神经节细胞有一定的保护作用。3米诺环素能增强视神经损伤后视网膜血管内皮生长因子（VEGF）的表达，从而发挥视网膜神经节细胞保护作用。