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肝细胞肝癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,具有发病率高和死亡率高等特点,严重的威胁人类健康。目前,人们正在积极的探索有效的治疗手段,如手术治疗、肝移植、肝动脉栓塞化疗、消融治疗、放疗、化疗、靶向治疗、免疫以及基因治疗等。尽管肝癌的治疗方法多种多样,但肝癌复发率高,并且易于转移的特点,使肝癌的5年总体生存率并没有显著提高,我们目前并不能完全根治这种疾病。近几年随着对肿瘤研究的不断深入,肿瘤的分子诊断和基于分子水平的治疗越来越受到重视,分子治疗被认为是有可能实现肿瘤根治的希望,并且分子诊断也可以用于早期的预防工作。大量研究表明,miRNAs是一类参与多种生物学过程的小分子片段。其中miR-340作为miRNAs中的一员,是调控肿瘤发生和恶化的一个重要因子。MiR-340在乳腺癌,胃癌和卵巢癌细胞的转移中都起到重要调控作用。与此同时,通过生物信息学预测网站发现DcR3基因可以与miR-340存在识别序列,并且参与多种癌细胞增殖和凋亡过程。DcR3在多种肿瘤细胞和炎症组织中上调表达,并被认为是一种预测炎症性疾病发展和肿瘤转移的潜在生物标志物。本研究目的是进一步深入探究miR-340与DcR3之间的关系以及挖掘二者是否对肝癌起着重要的调控作用。我们假设miR-340在癌组织和癌旁正常组织之间存在差异表达,参与肝癌疾病的发生和发展;miR-340通过靶向DcR3基因通路调控肝癌的发生发展。本研究结果将为肝癌的早期诊断和临床治疗提供分子基础,具有重要的临床参考价值。第一部分miR-340靶基因预测和肝癌患者组织差异表达分析目的:对比分析肝癌组织和癌旁组织中miR-340及DcR3基因的差异表达,进一步验证miR-340及DcR3基因与TGF-β/Smad信号通路是否存在调控关系。方法:1、应用靶标关系分析网站Target Scan、micrriorna.org联和基因序列网站NCBI、miRbase预测miR-340和DcR3二者之间的识别位点。2、随机收集肝癌患者的癌症组织和癌旁组织,利用qPCR法检测miR-340和预测靶基因DcR3的表达水平,SPSS 19.0分析了两组之间的差异水平和相关性。3、实时荧光定量检测TGF-β/Smad的表达量,SPSS 19.0分析DcR3与TGF-β/Smad相关性。结果:1、数据库分析发现,miR-340种子序列和DcR3基因3’UTR(100-106bp)之间有存在特异性识别序列。2、miR-340在肝癌组织呈现低表达,在正常组织中呈现高表达;而DcR3基因呈现相反的表达趋势,在肝癌组织中呈现高表达,在正常组织中表达量较低;另外,miR-340和DcR3相关性分析发现,二者呈显著负相关。3、TGF-β和Smad2均在肝癌组织中呈现高表达,并且与DcR3基因之间的表达趋势一致。结论:1、根据数据库预测发现,DcR3基因可能是miR-340的靶基因。2、在正常组织和癌旁组织之间miR-340和DcR3基因负相关的表达趋势预示着DcR3可能受控于miR-340,从而参与肝癌疾病的发生发展。3、DcR3可能激发肝纤维化TGF-β/Smad调控通路。第二部分miR-340和靶基因DcR3靶标关系验证目的:验证miR-340与DcR3基因之间的靶标关系。方法:1、通过miRBASE和NCBI数据库分别调取mi R-340成熟序列与DcR3基因3’UTR序列。2、培养HepG2细胞后,将miR-340 mimics分别与DcR3-WT、DcR3-mut、空载体si共转染到HepG2细胞;24h后利用多功能酶标仪检测各组细胞荧光素酶活性,从而判断miR-340与DcR3 3’UTR(100-106bp)结合能力。结果:成功构建了miR-340 mimics、mi R-340 inhibitor、miR-340shNC载体、DcR3-WT和DcR3-mut;并且miR-340 mimics与DcR3-WT共转染组的荧光素酶活比空载组低(P<0.01),而mi R-340 mimics与DcR3-mut共转染组与空载组无显著的差异(P>0.05)。结论:DcR3基因确实为miR-340的靶基因,并且与miR-340种子序列能结合。第三部分miR-340影响肝癌细胞增殖和凋亡的机制研究目的:1、检测miR-340对肝癌细胞增殖和凋亡水平的影响。2、验证DcR3基因对TGF-β/Smad2通路的影响。方法:1、培养HepG2细胞后,将miR-340 mimics,miR-340 inhibitor,miR-340shNC载体转染进细胞后,通过qPCR鉴定miR-340过表达和敲除的效果。再通过实qPCR和Western blot实验进一步检测DcR3基因的表达水平变化,判断miR-340对DcR3基因的影响。2、通过MTT检测miR-340过表达和干扰后肝癌细胞增殖能力。3、通过流式细胞术检测miR-340对肝癌细胞凋亡情况的影响。4、通过实时qPCR及Western blot实验检测DcR3基因对TGF-β/Smad2通路的激活作用。结果:1、miR-340 mimics组miR-340表达量显著高于miR-340shNC组,而mi R-340inhibitor组显著低于miR-340shNC组(P<0.05);DcR3基因mRNA与蛋白质在miR-340shNC、miR-340 inhibitor组均逐渐呈现上调表达趋势,在miR-340 mimics组呈下调趋势。2、miR-340 mimics组肝癌细胞的增殖能力与miR-340inhibitor组相比明显降低(P<0.05)。3、与对照组比较,miR-340 mimics组肝癌细胞凋亡率明显升高,而miR-340inhibitor组细胞凋亡率较低(P<0.05)。4、根据实验二已知miR-340可以下调DcR3的表达,而本实验发现DcR3基因的过表达可以激活TGF-β/Smad2通路;与对照组相比,DcR3高表达组会导致TGF-β和Smad2基因的mRNA和蛋白表达量显著上调。结论:1、miR-340能成功的下调靶基因的表达水平,说明miR-340可能通过降解靶基因mRNA和抑制蛋白翻译两种机制影响DcR3基因的表达。2、miR-340可以促进肝癌细胞凋亡,抑制细胞增殖能力。3、DcR3基因的高表达会激活TGF-β/Smad2通路。第四部分DcR3影响小鼠肝癌的形成和恶化目的:研究评价DcR3基因对小鼠肝癌形成的影响。方法:1、选取年龄和重量相似的小鼠,通过小鼠腹腔注射HepG2肝癌细胞株,制作小鼠肿瘤模型;在肿瘤形成后DcR3过表达载体尾静脉注射。2、通过qPCR和Western blot法检测DcR3和TGF-β/Smad通路。3、通过游标卡尺测量肿瘤的直径,评估DcR3对小鼠肿瘤的影响。结果:1、经过检测发现,DcR3过表达组的DcR3和TGF-β、Smad2的表达水平均显著高于阴性对照组(P<0.05)。2、DcR3质粒注射组肿瘤体积明显大于对照组(P<0.05)。结论:1、DcR3能明显促进肿瘤的形成。2、DcR3基因调控TGF-β/Smad2信号通路,影响肝癌的进展恶化。