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背景:肠缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)在临床上是一种常见的病理生理过程,常发生或继发于多种疾病状态,严重时将导致全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)甚至死亡。肠黏膜屏障是机体抵御外界侵袭的重要屏障。肠黏膜屏障一旦受损,极易导致肠内细菌异位、肠源性感染等,最终导致严重的多脏器功能障碍和衰竭。肠屏障功能障碍对危重疾病的发生、发展和转归有重要影响。肠缺血再灌注损伤是肠黏膜屏障功能损害的常见原因。因此,加强肠黏膜的修复,预防或减轻肠屏障功能损害,对脓毒症和MODS的防治具有非常重要的意义,但迄今为止还没有有效的治疗方法。其中,肠I/R损伤后小肠黏膜的再生修复对肠黏膜屏障的恢复起到了至关重要的作用,但关于再生修复的机制研究甚少。有研究表明,特异性泛素肽酶22(Ubiquitin-Specific Processing Peptidase 22,USP22)作为一种去泛素化酶,在体内调节着广泛而重要的生理作用,如生长发育、细胞周期、细胞信号的转导等,目前公认USP22在细胞周期、细胞增殖等方面起着重要的作用。本研究通过构建小肠缺血再灌注损伤的模型,探讨小肠再生修复的特征及规律,以及USP22对小肠黏膜再生修复的作用。目的:本研究旨在通过观察USP22对小肠上皮细胞增殖和修复的影响进而探究其在肠I/R损伤中的保护作用。方法:1、将50只健康成年雄性SD大鼠随机分为以下5组(每组n=10):假手术组(Control组)、模型组1(I/R组)、模型组2(I/R组)、模型组3(I/R组)、模型组4(I/R组)。其中,假手术组仅行肠系膜上动脉的手术分离但不夹闭;各模型组以微型无创动脉夹行肠系膜上动脉夹闭1h,再灌注3h、6h、12h或24h以构建肠缺血再灌注模型。再灌注结束后,分离收集实验对象小肠组织,采用HE染色观察其病理改变并对小肠组织行Chiu’s评分。采用免疫组化方法检测小肠组织石蜡切片的PCNA表达,同时利用Western-blot方法对小肠组织中USP22活性及Cyclin D1水平进行检测。2、采用IEC-6细胞构建肠上皮细胞缺氧/复氧(H/R)的模型:IEC-6细胞置于培养箱中低氧环境(5%CO2,1%O2)培养12h,结束后正常条件下复氧,复氧时间分别为3h,6h,12h及24h。用CCK-8细胞增殖实验检测细胞活性的变化,同时利用Western-blot法对各个分组中细胞的USP22活性及Cyclin D1水平进行检测。3、在体外干预USP22的表达,研究USP22在肠缺血再灌注中的保护作用:(1)构建细胞 H/R 模型(缺氧 12h,复氧6h),用 Lipofectamine3000,将 USP22的靶序列siRNA以及阴性对照序列导入细胞。(2)构建细胞H/R模型(缺氧12h,复氧6h),用Lipofectamine3000,将含有USP22基因的质粒以及阴性对照质粒导入细胞。评估缺氧复氧之后细胞活性的变化,采用流式细胞术检测细胞周期的变化,利用Western-blot法对各个分组中细胞的USP22活性及Cyclin D1水平进行检测。结果:1、与Control组相比,I/R组:大鼠小肠在缺血1h后,再灌注0～24h期间大致经历了损伤期和修复期二个阶段的形态变化。再灌注6h时损伤最严重,增殖最慢。其中小肠组织HE病理示细胞水肿、小肠绒毛排列紊乱断裂,黏膜及黏膜下间隙出血、水肿并形成明显溃疡,并且随时间延长而改变;小肠组织免疫组化结果示PCNA表达及小肠组织USP22及Cyclin D1的表达趋势与HE染色所示的小肠病理损伤趋势一致。2、在体外构建的IEC-6细胞模型中,相比于Control组,H/R组:随着复氧时间延长,细胞活性、USP22等蛋白的水平变化趋势与体内实验的结果相一致。3、(1)在体外的模型中,H/R+si-USP22组比H/R组细胞活性明显减弱,USP22及Cyclin D1表达趋势显著降低。经流式细胞术检测的细胞周期被阻滞在G1期。(2)在体外的模型中,H/R+USP22质粒组比H/R组细胞活性明显升高,USP22及CyclinD1表达趋势显著回升。结论:我们的研究结果表明,USP22的活性对于肠I/R损伤后小肠上皮细胞的细胞周期及相关蛋白表达有影响作用。USP22的过表达可以通过促进肠隐窝细胞的增殖恢复受损伤的肠黏膜,进而减轻肠I/R的损伤和相关的并发症。