目的：　　 提高人口质量,避免缺陷患儿出生,治疗先天性疾病已成为国人关注的焦点。分子遗传学一基因组学的迅速发展,促进了分子医学时代的到来,推动了多种复杂疾病致病基因的发现及其发病分子机理的认识。对于绝大多数遗传性眼病,目前临床上尚无真正有效可以逆转或者延缓其发生的治疗手段,尽管先天性白内障可以通过及早手术治疗使白内障盲得到不同程度的恢复,但由于婴幼儿视觉系统的特殊性,如眼球仍在发育,屈光状态不稳定,术后炎症反应重等,都大大增加了手术的风险和难度,另外术后弱视的治疗及对患儿的护理水平都与预后密切相关,就我国而言目前先天性白内障术后的复明率及脱残率并不容乐观,而且即使患儿可以获得高质量的手术,但是随之而带来的国家及家庭的财政支出极为庞大。由于目前对于绝大多数遗传性眼病尚无有效治疗方法,多以保守治疗、药物治疗并附以手术治疗为主,这不仅给患者及其家庭带来沉重的经济和精神负担,也无法采取有效的遗传干预杜绝疾病对后代的威胁。因此阐释遗传性眼病的发病机制非常重要,这对于在一定程度上预防或者延缓其发展具有重大而深远的意义。本课题通过对ALK3基因在晶体内条件敲除小鼠的研究从蛋白及分子生物学水平对胚胎发育过程中,ALK3对视网膜与晶状体之间相互诱导作用的影响及机制做深入的阐述。　　 材料和方法：　　 脊椎动物眼的发育需要晶状体和视网膜组织之间的相互诱导作用,这种相互诱导作用需要一定的信号传导途径,在胚胎发育过程中,Alk3是BMP信号转导通路上重要的受体,它的缺失可以导致眼部发育的异常,探讨它在晶体区的条件缺失对晶体的发育产生的诱导作用以及对视网膜组织的发育产生的影响。通过这些观察对胚胎发育过程中晶状体和视网膜组织之间相互诱导作用的机制做进一步的阐述。本实验采用Alk3受体在晶体内条件敲除的小鼠,Alk3fl/fl;LeCre,Alk3fl/+;LeCre。母鼠alk3fl/fl配公鼠lecrealk3fl/+;或者母鼠alk3fl/+配公鼠lecrealk3fl/fl,产生实验组:50%lecrealk3fl/fl,对照组:50%lecrealk3fl/+。ALK3基因敲除小鼠饲养于SPF级动物实验室里,采用1只雄鼠与2只雌鼠同居的方式进行繁殖。进行鼠尾DNA的提取,然后基因型鉴定,取胚胎,DEPC-PBS洗两次,4%PFA固定,过夜(把胎鼠的编号标好,取鼠尾做PCR),石蜡包埋,然后HE染色。免疫荧光检查,一抗是sc-9305bmp7(santacruzUS),二抗是IF-0314aGOIgG/FITC(santacruzUS),石蜡切片常规脱蜡:二甲苯5分钟×3次,100%乙醇5分钟2次,90%乙醇2分钟,70%乙醇2分钟,40%乙醇2分钟,PBS5分钟:枸橼酸缓冲洗,微波抗原修复;蒸馏水冲洗,PBS浸泡3分钟×2次,4%过氧化氢室温孵育20分钟以清除内源性过氧化物酶的活性,PBS浸泡3分钟×2次;正常羊血清室温孵育20分钟,封闭非特异性抗原;吸去羊血清,然后加入一抗,4℃孵育过夜;PBS洗3次,加入二抗,避光孵育1h,PBS洗3次;磷酸甘油封片,荧光镜下观察。原位杂交实验,BMP4原位杂交试剂编号为MK1784-m(BOSTER),灭活内源性酶:加3%H2O2水于组织切片上,室温10分钟,以灭活内源性酶,蒸馏水洗;暴露mRNA核酸片断:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶,37℃或室温消化15分钟,PBS洗3次x5分钟,蒸馏水洗1次;后固定:加1%多聚甲醛室温固定10分钟,蒸馏水洗3次;预杂交:每切片加20μL预杂交液,湿盒中42℃2-4h。吸弃多余液体,不洗;杂交:每切片加20μL杂交液,将硅化盖玻片置于切片上,湿盒中42℃16-20h;杂交后洗涤;封闭:滴加封闭液,37℃30分钟。甩去多余液体,不洗;标记:滴加生物素化鼠抗地高辛,37℃60分钟。PBS洗5分钟x4;SABC:滴加SABC,37℃20分钟。PBS洗5分钟×3;二抗:滴加生物素化过氧化酶,37℃20分钟。PBS洗5分钟×4;DAB显色;复染;脱水透明;封片。　　 结果：　　 ALK3在晶体的发育过程中起重要的调节作用,但ALK3的缺失并不会导致晶体发育的缺失。在ALK3晶体内条件敲除的小鼠与对照组的比较中,晶体的形态学变化差异从E13.5d开始可以分辨,在E15.5d已经发生了显著性的差异,但实验组和对照组均有晶体的发育。BMP7在胚胎发育过程中表达于晶体中,而且其表达受ALK3的影响。在ALK3晶体内条件敲除的小鼠,BMP4,BMP7在晶体内的表达显著减少,尤其在胚胎发育的中后期(E13.5d-E15.5d);而在对照组中BMP,4,BMP7的表达则不受影响。ALK3在晶体内条件敲除可以影响视网膜的发育,但不会导致视网膜的不发生,在ALK3晶体内条件敲除的小鼠与对照组的比较中,视网膜的形态学变化差异从E13.5d开始出现,在E15.Sd有了显著性的差异,明显出现了视网膜厚度和分化的不同,但实验组和对照组均有视网膜的形成发生。BMP7在胚胎发育过程中表达于视网膜中,当ALK3在晶体内条件敲除后,BMP7在视网膜内的表达也受到影响。在ALK3晶体内条件敲除的小鼠中,BMP7在视网膜内的表达显著减少,尤其在胚胎发育的中后期(E13.5d-E15.5d);而在对照组中BMP7的表达则不受影响。这说明了胚胎发育过程中晶体组织对视网膜的发育具有调节作用。　　 结论：　　 ALK3在晶体和视网膜的发育过程中起重要的调节作用,但ALK3的缺失并不会导致晶体、视网膜发育的缺失。ALK3晶体内条件敲除的小鼠随着胚龄的增加,晶体的形态学变化日益明显,虽然有晶体的发育,但发育不良、形态缺陷明显。BMP7在胚胎发育过程中表达于晶体和视网膜中,而且其表达受ALK3的影响。在ALK3晶体内条件敲除的小鼠,BMP7在晶体以及视网膜内的表达显著减少,BMP4在晶体内的表达也减少,尤其在胚胎发育的中后期。我们通过本实验进一步证实了在胚胎发育过程中,晶体与视网膜之间的相互诱导作用是存在的。