近年来的研究发现，在肿瘤局部存在阻碍效应细胞活化的因素，并据此提出了肿瘤微环境的概念。认为肿瘤周围包括肿瘤细胞本身、间质细胞、微血管、组织液及少量浸润细胞，如树突状细胞、巨噬细胞等，共同构成了肿瘤的微环境。作为肿瘤细胞的避难所，肿瘤微环境保护其免受免疫细胞的识别和攻击，诱导免疫耐受。可以看出，肿瘤微环境免疫抑止状态的解除是肿瘤免疫治疗成败的关键，这也为肿瘤治疗提供了新的靶点。 早在300多年前，就有临床报道发现肿瘤患者局部遭受细菌或病毒感染时，伴随肿瘤明显消退，其原因可能是局部细菌感染引发的炎症反应在一定程度上解除了肿瘤微环境的免疫抑制状态，暴露了肿瘤抗原，促进效应细胞的活化，达到杀灭肿瘤的目的。根据这个提示，我们提出一种新的肿瘤治疗模式，利用异种抗原免疫序贯瘤内注射的方法治疗肿瘤。通过异种抗原免疫，增强机体的非特异性免疫力，产生记忆性T细胞及抗体，随后异种抗原瘤内注射，在肿瘤局部引发免疫清除反应。一方面，局部注射的异种抗原成为一个人工靶点，吸引抗体及招募免疫细胞在肿瘤局部大量聚集。另一方面，肿瘤局部的免疫反应产生大量的细胞因子及趋化因子，在肿瘤局部制造出一种炎症环境，打破免疫抑制状态，促进免疫效应细胞的成熟及活化，最终实现将机体针对异种抗原的排斥反应转化为对肿瘤的免疫应答。为了验证这种治疗方法的可行性，探讨其对肿瘤微环境的改善作用，我们设计了两部分实验。 第一部分:异种抗原免疫序贯瘤内注射对小鼠肿瘤的治疗作用 目的：检验异种抗原免疫序贯瘤内注射方法治疗肿瘤的可行性和有效性。 方法：实验选择昆明小鼠及S180肉瘤造模，选择灭活含链球菌培养基。将含链球菌培养基灭活，杀灭溶血素、外毒素等毒性作用因子，消灭细菌的侵袭性，使其不具备体内繁殖和感染细胞的能力，保证了安全性。同时细菌培养基中大量的脂磷壁酸及甘露聚糖又可以提高机体的非特异性免疫力。制剂中含链球菌完整菌体和细胞壁成分，包含胸腺依赖性抗原和胸腺非依赖性抗原，增加了免疫源性，刺激机体产生记忆性T细胞及抗体，满足实验的设计条件。实验小鼠分成免疫后细菌注射组，免疫后盐水注射组，未免疫细菌注射组，未免疫盐水注射组四组。应用灭活链球菌制剂0．1ml/次/只，采用1、7、14、28天腹腔免疫的方法。免疫后利用凝集反应检测体内的抗体效价，沉淀显示效价达到1：128。分免疫和瘤内注射两个因素，进行分析。计算小鼠的中位生存期、抑瘤率，利用AnnexinⅤ FITC流式细胞术及TUNEL原位凋亡检测两种方法检测细胞凋亡率。 结果： 1．所有模型小鼠中，免疫后细菌注射组的小鼠中位生存时间为54天，与免疫后盐水注射组（34天）、未免疫细菌注射组（43天）、未免疫盐水注射组（25天）相比，存在显著差异（P=0．001，P=0．001，P=0．001）。 2．免疫因素及瘤内注射因素对控制肿瘤生长均有显著作用（P=0．026，P=0．000），但瘤内细菌注射或者瘤内盐水注射组内免疫因素未表现出显著作用。免疫后细菌注射组和未免疫细菌注射组的瘤重明显小于未免疫盐水注射组（P<0．05），抑瘤率分别为80．3%及63．8%。 3．肿瘤细胞的凋亡率使用A-nnexin-Ⅴ流式细胞仪检测及TUNEL原位凋亡检测。结果显示瘤内注射因素对细胞凋亡有显著影响，免疫后细菌注射组肿瘤细胞凋亡率远高于其它组。两种检测方法结果无统计学差异（P=0．103）。 第二部分:细菌免疫序贯瘤内注射对肿瘤微环境的影响 目的：研究异种抗原免疫序贯瘤内注射对肿瘤免疫微环境的影响。 方法：小鼠的处理及分组与第一部分相同。处死小鼠，留取少量组织固定，其余肿瘤组织制备单细胞悬液，利用不连续密度梯度离心的方法分离肿瘤细胞及肿瘤浸润淋巴细胞。收集分离单个核细胞时组织研磨上清液。使用流式细胞仪检测MHCⅠ类分子及肿瘤浸润淋巴细胞的表达，使用免疫组化方法检测CD86、树突细胞的表达。使用ELISA方法检测肿瘤组织匀浆上层清液中的IL-2、TNF-α、IFN-γ和C5a的浓度。使用荧光定量PCR的方法检测肿瘤细胞P16 mRNA和VEGF mRNA的相对表达量。使用免疫组化法利用CD49b抗原检测整合素α2的表达。使用免疫组化法利用CD34抗体检测微血管密度。 结果： 1．免疫因素及瘤内注射因素可以显著影响小鼠肿瘤细胞的MHCⅠ类分子表达（P=0．013，P=0．002）。免疫后细菌注射组的肿瘤MHCⅠ类分子表达率最高。 2．CD86分子表达在免疫后细菌注射组的平均秩次最高，但是各组之间没有统计学差异（P=0．204）。组化片可见CD86在细胞膜、胞浆、胞核三种表达方式，但后两种表达方式并不能完成正常生物学功能。 3．各组小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+T细胞比例不存在统计学差异。免疫因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+T细胞比例无影响（F=0．839，P=0．371），但瘤内注射药物因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+T细胞比例有显著影响（F=6．469，P=0．019）。 4．免疫因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+T细胞比例有显著影响（F=4．468，P=0．047），瘤内注射药物因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+T细胞比例也有显著影响（F=19．583，P=0．000），两个主因素没有交互作用（F=1．141，P=0．298）。 5．免疫因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD8+T细胞比例有显著影响（F=4．752，P=0．041），瘤内注射药物因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD8+T细胞比例也有显著影响（F=26．602，P=0．000），两个主因素没有交互作用（F=1．555，P=0．227）。 6．免疫因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+T与CD3+CD8+T比值没有显著影响（F=1．67，P=0．21）。瘤内注射药物因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+T与CD3+CD8+T比值也没有明显影响（F=3．733，P=0．068）。 7．免疫因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+CD25+T细胞比例没有显著影响（F=0．569，P=0．459），瘤内注射药物因素对小鼠肿瘤浸润淋巴细胞的CD3+CD4+CD25+T细胞比例存在显著影响（F=14．269，P=0．001），两个主因素没有交互作用（F=3．419，P=0．079）。 8．免疫因素对IL-2的浓度存在显著差异（F=7．428，P=0．013），瘤内药物注射对IL-2的浓度也有显著影响（F=26．29，P=0．000），两个因素之间不存在交互作用（F=4．174，P=0．054）。 9．免疫因素对TNF-α的浓度有显著影响（F=6．522，P=0．019），瘤内药物注射对TNF-α的浓度也有显著影响（F=22．573，P=0．000），两个因素之间存在交互作用（F=8．946，P=0．007）。 10．免疫因素对IFN-γ的浓度有显著影响（F=6．749，P=0．017），瘤内细菌注射对IFN-γ的浓度也有显著影响（F=25．074，P=0．000），两个因素之间存在交互作用（F=6．799，P=0．017）。 11．瘤内注射可显著增加局部C5a的浓度（P=0．000），而免疫因素则无影响。 12．免疫后细菌注射组的P16 mRNA相对表达量明显高于其他组（P=0．000）。 13．α2阳性表达细胞多存在于肿瘤周边，实质内很少见到，各组之间无统计学差异（P=0．052）。 14．免疫因素及瘤内注射因素对肿瘤微血管密度均有显著影响（P=0．000，P=0．000）。免疫后细菌注射组的肿瘤内部CD34表达量最低，对应的免疫后细菌注射组VEGF mRNA的相对表达量较其他组显著降低（P=0．000）。 本文结论： 1．异种抗原免疫序贯瘤内注射可以诱导肿瘤细胞的凋亡、坏死，控制肿瘤的生长速度，延长瘤荷小鼠的生存期，对瘤荷小鼠的肿瘤具有很好的控制作用。 2．异种抗原在肿瘤局部制造急性炎症环境，可以显著增加肿瘤微环境中肿瘤细胞表面MHCⅠ类分子的表达、CD3+CD4+T细胞和CD3+CD8+T细胞的比例、P16 mRNA相对表达量以及IL-2、TNF-α和IFN-γ的浓度，同时降低CD3+CD4+CD25+T细胞比例、VEGF mRNA相对表达量以及微血管密度。以上作用结果均可以通过单独瘤内细菌注射产生，免疫因素则是对瘤内注射治疗的有力支持。 3．对CD4+Th细胞的调节作用，可能是异种抗原调控局部微环抗肿瘤作用机制的中心环节。 4．提前给予多次外周免疫，可以增强机体非特异性免疫力，产生记忆性T细胞及抗体。在瘤内注射相同抗原后，促进T细胞更快的活化和成熟，取得更好的治疗效果。选择的α溶血性链球菌本身为人体咽喉部位常规定植菌群，对人体无致病力，并且体内存在其抗体。为下一步的临床使用提供了条件。 5．由于疫苗的应用，人体中已存在大量的抗体，这为本文治疗方法的临床应用提供了有利条件，同时也为治疗制剂的选择提供了广阔的空间。