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目的乳腺癌是一种严重危害全世界女性身心健康的恶性肿瘤。目前临床上常用的治疗手段,如手术治疗、放疗、化疗和免疫治疗等都存在各自的缺陷,因此急需开发新的方法和策略来治疗乳腺癌。光学治疗是这几年来研究较为广泛的肿瘤治疗方法,主要包括光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)。光学疗法具有诸多优点,如高度的空间选择性、无创或微创,以及较低的耐药性等,并在肿瘤治疗中表现出良好的应用前景。本论文以七甲川花菁素类染料IR780为光敏剂,偶联细胞穿膜肽TAT,合成具有肿瘤渗透性能和细胞核靶向性能的光敏分子TAT-IR780,并制备其纳米粒用于包载化疗药物阿霉素(DOX),构建能够联合PTT/PDT和化疗的纳米治疗体系(TID纳米粒)。该纳米治疗体系可通过对肿瘤的高渗透及细胞核靶向作用高效递送IR780和DOX至肿瘤深部发挥直接杀伤作用,在消融原位乳腺肿瘤的同时能够抑制其复发。本论文还系统地研究了 PTT效应加速TID纳米粒中DOX的释放、细胞核靶向的PTT/PDT和化疗的联合抗乳腺癌作用及其相关机制。内容本论文的研究内容分为三部分。第一部分为TID纳米粒的制备与表征,包括TAT-IR780的合成与化学结构的确证;TID的制备、表征及其释药性能、光学稳定性及体外PTT效率的考察。第二部分为TID纳米粒的体外抗肿瘤作用研究,包括细胞毒性、入胞性能与胞内分布、细胞凋亡以及体外PTT/PDT效应的考察。第三部分为TID纳米粒的体内抗肿瘤作用研究,主要包括4T1乳腺癌原位小鼠肿瘤模型的构建、TID纳米粒的体内PTT/PDT性能及其联合PTT/PDT与化疗的协同抗肿瘤疗效考察。方法1.TID纳米粒的制备与表征:IR780与TAT通过亲核取代反应偶联生成TAT-IR780,并借助傅里叶变换红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱(1H-NMR)与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对其化学结构进行表征;通过紫外分光光度计(UV)考察TAT-IR780的光学稳定性;以TAT-IR780为载体材料,采用纳米沉淀法制备携载DOX的TID纳米粒,借助粒径和Zeta电位分析仪检测纳米粒的粒径及其分布、表面电荷性质与稳定性;利用透射电镜(TEM)观察TID纳米粒的形貌;通过紫外分光光度计(UV)和荧光分光光度计(FL)考察TID纳米粒的稳定性;借助红外成像仪考察TID纳米粒的光热转换性能;通过动态透析法考察TID纳米粒在不同pH条件以及有无激光照射下的体外释药特征。2.TID纳米粒的体外抗肿瘤作用研究:通过MTT实验和活死细胞染色实验检测TID纳米粒对4T1细胞的毒性作用;运用流式细胞仪和共聚焦显微镜考察TID纳米粒在4T1细胞中的摄取情况及其胞内亚细胞分布;利用流式细胞术考察TID纳米粒对4T1细胞凋亡的诱导效应,并通过检测细胞色素c(Cytc)在胞内的亚细胞分布,探讨凋亡诱导的激活机制;采用红外热成像仪监测温度的变化,采用免疫荧光法考察细胞内热休克蛋白HSP60的表达水平以及细胞核中γ-H2AX的表达水平和53BP1的分布状态,用以评价TID纳米粒在激光照射下的体外PTT效应;以DCFH-DA为荧光探针,采用流式细胞仪和共聚焦显微镜检测光照及非光照条件下TID纳米粒触发4T1细胞中活性氧(ROS)的生成水平,评价TID纳米粒的体外PDT效应。3.TID纳米粒的体内抗肿瘤作用研究:将4T1细胞皮下种植于小鼠右侧腹股沟处构建小鼠乳腺癌模型;瘤内注射TID纳米粒,通过红外热成像仪检测激光照射下小鼠肿瘤部位的温度变化情况,评价TID的体内PTT效应,同时利用ROS荧光探针SOSG检测肿瘤阻滞的ROS水平,评价TID纳米粒的体内PDT效应;瘤内注射给药并进行激光照射治疗后,监测小鼠肿瘤体积与体重变化,连续监测20 d,考察TID纳米粒的体内抗肿瘤作用;治疗结束后,对小鼠的肿瘤组织进行H&E、Tunel、Ki67与γ-H2AX染色等组织病理学检查,评价TID纳米粒对乳腺癌的协同治疗作用。结果1.合成了偶联物TAT-IR780,具有两亲性,能够在水性介质中自组装形成TIR纳米粒;以TAT-IR780为载体材料,采用纳米沉淀法制备获得负载DOX的TID纳米粒。TID纳米粒的粒径约100 nm,TEM结果显示其呈现规则的球状形貌且分散性良好。紫外图谱和荧光强度变化显示游离IR780在水中稳定性较差,而TIR与TID纳米粒的光学稳定性显著增强。在近红外激光(785 nm,1.0 W/cm2)的照射下,TID纳米粒将溶液温度提升并稳定于60℃,表明TID纳米粒具有良好的光热转换效率和光学稳定性。体外药物释放结果显示,DOX的释放具有一定的pH响应性,施加激光照射后,DOX在pH 6.5介质中的释放进一步增加,说明PTT效应能够加速TID纳米粒中DOX的释放。2.在乳腺癌4T1细胞中,TID纳米粒能够被高效地摄取,并主要定位于近细胞核区域。光照后细胞内HSP60表达显著上调,核内γ-H2AX的表达和53BP1分布状态均发生了明显的变化,证明TID纳米粒具有细胞核靶向的PTT效率,能够直接损伤核内DNA;同时,光照后细胞内ROS生成水平也大大提升,证明TID纳米粒兼具较高的PDT效率。TID纳米粒结合光照能够显著抑制4T1细胞的体外生长,诱导细胞凋亡,表现出PTT/PDT与化疗的协同抗肿瘤作用;此外,细胞中Cyt c发生了从线粒体到细胞质的转位,说明凋亡诱导机制是激活了线粒体凋亡通路。3.成功构建小鼠乳腺癌模型。TID纳米粒经瘤内注射给药后,能够渗透进入肿瘤深部;结合激光照射,肿瘤局部温度升至60℃,且保持相对恒定,说明TID纳米粒具有显著的体内PTT效应;SOSG荧光探针实验结果显示肿瘤组织内ROS生成水平大大提升,证明TID纳米粒具有显著的体内PDT效应。在4T1-荷瘤小鼠体内,TID纳米粒结合激光照射表现出PTT/PDT与化疗的协同治疗作用,高效地抑制了体内肿瘤的生长与复发;肿瘤组织的H&E、Ki67、Tunel和γ-H2AX染色实验结果表明肿瘤细胞产生了严重的损伤与凋亡。此外,治疗期间小鼠体重无显著变化,且主要器官也没有产生明显的组织病理学改变,说明TID纳米粒介导的联合治疗具有较高的生物安全性。结论本研究设计并成功制备了一种共载光敏剂IR780和化疗药物DOX,且具有细胞核靶向性能的纳米治疗体系TID纳米粒,以期实现对乳腺癌的联合治疗。TID纳米粒是IR780与穿膜肽TAT的偶联物TAT-IR780与DOX通过纳米沉淀法制备得到的,具有较高的体外稳定性和显著的PTT/PDT效率。在细胞水平,TID纳米粒能够靶向并富集于近细胞核区域,结合激光照射能够高效杀伤4T1细胞,并诱导其凋亡。在4T1荷瘤小鼠体内,TID纳米粒经瘤内注射给药后,能够显著抑制肿瘤的生长与复发,并表现出较高的生物安全性。综上,TID纳米粒能够联合细胞核靶向的PTT/PDT和化疗获得对乳腺癌的协同治疗作用。