M期促进因子(M-phase Promoting Factor，MPF)又叫细胞分裂周期2(Celldivision cycle2，Cdc2)/（细胞周期蛋白B，CyclinB）复合物，在减数和有丝分裂细胞周期中是关键的调节因子，并被认为是在细胞周期不同调控途径中起整合信号的中心枢纽，其活性的调节主要通过磷酸化/去磷酸化Cdc2上的Thr14和Tyr15来发挥作用，而Cdc2上这两个关键位点的磷酸化状态是由Wee1蛋白激酶和Cdc25磷酸酶的活性平衡来调节，通过影响MPF活性，精密地调节卵母细胞成熟及受精卵有丝分裂等特殊的细胞周期事件。一旦开始激活，MPF通过Wee1和Cdc25形成的反馈环被进一步激活。　　Wee1蛋白激酶家族通过磷酸化失活细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin dependentkinase，CDK)来负调控细胞周期进程。Wee1缺失可使有丝分裂提前成熟，导致体积变小，因此命名为‘Wee’的亚型。Wee1能磷酸化Ser, Thr和Tyr残基，属于双特异性蛋白激酶。Wee1A激酶在细胞核中通过磷酸化Tyr15来抑制Cdc2激酶的活性。而Wee1家族的另一个成员，Myt1则通过结合Cdc2/cyclin B复合体，将其定位在细胞质，并磷酸化其Thr14/Tyr15，Myt1优先磷酸化Thr14，作为膜结合激酶来抑制G2/M期的进程。在人，小鼠，猪，恒河猴的卵母细胞中，第二个Wee1基因—胚胎细胞Wee1B存在，仅在最近才有报导，其表达方式与爪蟾的Wee1A相似，在减数分裂停滞过程中发挥重要作用。Wee1B的作用与Wee1A一样，在细胞核中通过磷酸化Tyr15来抑制Cdc2激酶的活性。　　蛋白激酶A(protein kianseA，PKA)广泛参与调节多种真核细胞的细胞周期进程，PKA的这种负性调节作用主要体现在对下游蛋白的磷酸化调节上。有研究表明小鼠卵母细胞中Wee1B蛋白是PKA的潜在底物，PKA通过磷酸化小鼠Wee1B蛋白的15位Ser，激活Wee1B蛋白激酶，磷酸化Cdc2上15位Tyr，进而抑制MPF的活性，卵母细胞发生G2期阻滞。但Wee1B是否在小鼠受精卵各细胞时期表达？对小鼠受精卵细胞周期的调控机制是什么？通过什么样的信号通路发挥作用？目前尚不清楚。上述问题的解决对阐明Wee1B调控小鼠受精卵各细胞时期的机理具有十分重要意义。　　关于PKA对小鼠Wee1B蛋白的作用，本研究室应用Scansite分析软件对小鼠Wee1B蛋白序列进行预测和分析并结合PKA磷酸化作用底物的模序（K/R）（K/R）X(S/T)，预测了小鼠Wee1B蛋白中PKA可能的磷酸化靶位点是Ser15。然而，在哺乳动物细胞内Wee1B是否为PKA的直接作用底物，Wee1B S15位点的磷酸化状态是否影响小鼠受精卵的细胞周期进程还未见报道。　　本研究首先检测小鼠1-细胞期受精卵Wee1B的表达和定位;其次，沉默和过表达Wee1B蛋白研究Wee1B在小鼠受精卵早期发育中对有丝分裂的影响;最后利用定点突变技术构建S15的非磷酸化(S15A)和模拟磷酸化的突变体(S15D)，探讨PKA的重要靶点15位Ser对小鼠受精卵早期发育的影响，为揭示PKA/Wee1B通路调控小鼠受精卵早期发育机制提供重要实验依据。因此，深入探讨小鼠受精卵早期发育中Wee1B的表达、功能、定位及其与MPF之间的关系，对阐明Wee1B调控哺乳动物受精卵早期发育的分子机理有十分重要意义，也为肿瘤增殖、转移等临床疾病的机理研究开辟新的途径。　　材料与方法:　　一、材料与试剂　　中国医科大学实验动物部提供昆明系SPF级雌性(4～5周，16～18g)、雄性(8周，30～35g)小白鼠[许可证号:SCXK(辽宁)2008-0005];质粒pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1 B-WT/KD由Marco Conti教授(University of California,San Francisco)惠赠;质;pGCsi-U6-GFP由上海吉凯基因有限公司提供;RNA PCR(AMV)Ver3.0试剂盒(Takara公司);mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra kit体外转录试剂盒(Ambion公司);快速微量mRNA提取纯化试剂盒(GE Healthcare UK公司);QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒(Stratagene公司);去内毒素质粒中量提取试剂盒(Omega公司);CDC2-pTyr15磷酸化抗体、β-Actin抗体、PKA抑制剂H-89(SantaCruz公司);小鼠Wee1B和Wee1B-S15磷酸化抗体和非磷酸化抗体由Signalway Antibody公司合成;TRITC标记的山羊抗兔IgG、HRP标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司);二丁酰环磷酸腺苷(dbcAMP)、M2和M16培养液、透明质酸酶(Sigma公司);孕马血清促性腺激素(PMSG，天津华孚高新技术生物公司)、人绒毛膜促性腺激素(hCG，上海生物胜华制药);其他试剂为国产分析纯。　　二、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养　　昆明系SPF级4～5周龄成熟雌鼠(18～22g)，腹腔注射孕马血清促性腺激素(pregnant mares serumgonadotropin，PMSG)10 IU/只;PMSG注射后46～48 h后腹腔注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG)10 IU/只，当晚与8周龄以上性成熟雄性小鼠(30～35g)合笼过夜。次日晨脱颈法处死雌鼠，取双侧输卵管，剪下末端膨大置M2培养液中取出受精卵，在M16培养液中清洗后转入12孔板，每孔加入200μL M16培养液，在37℃，5％ C02培养箱内培养至指定时间点进行收集冻存于-70℃或进行实验。　　三、RT-PCR实验　　100个各期受精卵按QuickPrep micro mRNA Purification试剂盒说明书进行mRNA的提取，按TaKaRa RNA PCR(AMV)Ver3.0试剂盒操作步骤进行反转录和PCR。PCR引物序列:mWee1B(NM_201370.2)5-CGCAAAGGGAACTTTCCAGAG-3和5-TGTAGCAAAAGGCCAGAAGTG-3;以β-Actin(NM_007393)作为内对照，引物为:5-TGACGGGGTCACCAACTGTGCCCATCT-3和5-AGAATGTAGTCCGCCAGGTC-3，反应产物经1％琼脂糖凝胶电泳后成像。　　四、Western印迹实验　　按时收集小鼠1-细胞各期受精卵各150个，加入20μL蛋白裂解液，经过3次反复冻融裂解细胞，置于-20℃备用。电泳前，加入5×SDS样品缓冲液，100℃煮沸，瞬时离心后上样，10％ SDS-PAGE电泳分离，将蛋白转移至PVDF膜上，3％ BSA封闭1h，封闭后的PVDF膜再与Wee1B抗体、Cdc2-pTyr15、Wee1 B-Ser15磷酸化抗体、Wee1 B-Ser15非磷酸化抗体及β-Actin抗体4℃温育过夜。经TBST洗涤3次后，HRP偶联的兔抗山羊IgG或山羊抗兔IgG4℃温育2h，TBST洗膜后，ECL发光法显色。　　五、间接免疫荧光实验观察内源性Wee1B蛋白的亚细胞定位　　各期受精卵于4％多聚甲醛4℃固定过夜，0.1％ Triton-X100打孔30 min，3％BSA封闭1～2 h，将卵细胞转入Wee1B一抗中4℃孵育过夜，次日用PBS缓冲液洗涤以去除未结合的一抗，TRITC标记的山羊抗兔IgG37℃孵育30 min。加入Hoechest33258荧光染料使核酸着色3～5min，激光共聚焦显微镜下观察Wee1B蛋白在受精卵中的定位。　　六、小鼠Wee1B-shRNA质粒的构建和质粒去内毒素　　根据小鼠Wee1B序列，设计并合成含干扰序列的正反双链DNA oligo:GATCCCCTCTTTGTCTCTGGTCAATATTTCAAGAGAATATTGACCAGAGACAAAGAGTTTTTGGAT，利用两端含限制性内切酶AgeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的粘端，将引物退火形成带粘性末端的双链，连接到目标载体pGCsi-U6/Neo/GFP上，菌落PCR筛选正确的重组子并测序验证。将测序正确的单菌落培养物扩增质粒，按照OMEGA内毒素质粒中量提取试剂盒提取。　　七、突变体的构建和体外转录　　以pcDNA3.1/V5-His-TOPO-Wee1B-WT为模板，设计并合成基因定点突变引物:Wee1B-S15A突变体(5-CTGAACAAGAAATTAGCCTTCTCCTTT-3,5-GCTAATTTCTTGTTCAGTCCCTGGTCA-3)和Wee1B--S15D突变体(5-CTGAACAAGAAATTAGACTTCTCCTTT-3,5-TCTAATTTCTTGTTCAGTCCCTGGTCAG-3)，PCR扩增突变链，DpnⅠ限制酶消化亲代未突变的DNA模板，PCR产物转化XL-1-Blue超感受态菌并提取质粒并测序。质粒Wee1B-WT/KD/S15A/S15D经XholⅠ酶切线性化后，应用体外转录试剂盒mMESSAGE mMACHINE kit将线性DNA体外转录成带帽mRNAs，纯化沉淀mRNAs后溶解于TE缓冲液中，定量mRNA后用于显微注射。　　八、显微注射与形态观察　　显微注射应用Eppendorf Transferman显微操作系统，OlympusX-70倒置显微镜和DIC型相差显微镜观察。将10 pL的Wee1 B-WT/KD/S15A/S15D注入受精卵胞浆，每个受精卵注射0.03ng。将1mg/mL Wee1 B-shRNA注入受精卵细胞核。接受mRNAs或shRNA注射的受精卵放入M16培养液中培养。为了观察PKA对Wee1B及受精卵发育的影响，分别向M16培养基中加入2 mmol/L PKA激活剂dbcAMP或40μmol/L PKA抑制剂H-89培养1h，同时再注射各种mRNAs。注射后的受精卵定时更换M16培养液以持续激活或抑制PKA，观察受精卵卵裂情况、细胞形态变化、MPF活性及Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。设置未注射组和TE缓冲液注射组作为对照组。　　九、MPF活性测定　　收集不同时期的小鼠受精卵，反复冻融3次，使细胞裂解，加入MPF反应液25μL，30℃水浴反应30min。产物加入25μL2×SDS上样缓冲液煮沸3min以终止反应。然后取一部分样品(25μL)点在Whatman P81强阳离子交换滤纸上，75mmol/L磷酸溶液终止反应，将滤纸置于液闪瓶内，Beckman液闪计数仪测定cpm值。另一部分活性反应后的样品(25μL)进行SDS-PAGE电泳分离，通过底物组蛋白H1带有的32p感光胶片，显影，漂洗，定影，冲洗，晾干。　　十、数据处理　　每组实验重复2～4次，各组数据以(x)±s表示，应用GraphPad Prism5软件进行数据统计与分析，多样本均数检验采用方差分析的方法。P＜0.05为差异有显著性意义，P＜0.01为差异有极显著性意义。　　实验结果:　　一、小鼠1-细胞期受精卵Wee1B的表达和定位　　RT-PCR结果表明，Wee1B在受精后各个时期都有表达，且无显著性差异。Western blotting结果显示，G1期Wee1B蛋白开始表达，到S期表达增加，一直到G2期都是高表达，到M期蛋白表达减少。免疫荧光结果表明:G1期和S期细胞Wee1B蛋白主要分布于细胞核;G2期细胞Wee1B蛋白弥散分布于细胞浆;M末期到2-细胞期可见Wee1B蛋白又重新分布于细胞核，细胞浆内荧光减弱。　　二、Wee1B-shRNA抑制Wee1B的mRNA水平和蛋白表达　　与对照组TE缓冲液、Control shRNA注射组相比，1.0μg/μL Wee1B-shRNA可以明显降低内源性Wee1B的mRNA和蛋白表达。结果提示Wee1 B-shRNA对Wee1B的mRNA水平和蛋白表达具有明显的抑制作用。　　三、显微注射Wee1B-shRNA对小鼠受精卵发育影响　　（一）Wee1 B-shRNA促进1-细胞期受精卵的卵裂率　　与未注射组、TE缓冲液注射组和Control shRNA注射组相比，Wee1 B-shRNA注射组在hCG注射33 h后的卵裂率明显提高18％。　　（二）MPF活性变化　　Wee1B shRNA注射组MPF活性在hCG注射后27.5 h明显上升，28.5 h达到高峰，比对照组提前30min到达高峰，之后缓慢下降。　　（三）Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测　　Wee1B shRNA注射组在hCG后28 h检测到较弱磷酸化信号，28.5 h几乎检测不到任何磷酸化条带，提示Cdc2-Tyr15的磷酸化状态与MPF活性变化相一致。　　四、小鼠Wee1 B蛋白的PKA作用靶位点的确定　　利用Scansite分析软件和NetPhos2.0 Server分析软件，并结合PKA磷酸化作用底物的模序，同时结合文献报道，最后选定小鼠Wee1 B蛋白中Ser15作为PKA最可能的磷酸化位点，并且这个位点符合PKA作用的一致序列KKLS。　　五、显微注射Wee1B-mRNAs对小鼠受精卵发育的影响　　（一）Wee1B蛋白表达水平的检测　　受精卵显微注射Wee1B各种mRNAs4 h后，与未注射组和TE缓冲液注射组相比，Wee1B蛋白呈现高水平表达。　　（二）小鼠受精卵卵裂率统计及形态观察　　Wee1B-WT-mRNA注射组在hCG后29～29.5 h开始出现卵裂，至31h卵裂率为35.1％，明显低于对照组;Wee1B-KD-mRNA注射组与对照组无明显差异;Wee1B-S15A-mRNA注射组与WT-mRNA注射组无明显差异;而Wee1 B-S15D-mRNA注射组几乎在hCG后29.5 h开始进入M期，至31h卵裂率为24.77％，与对照组相比有显著性差别。　　（三）MPF活性的变化和Cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测　　未注射组和TE缓冲液注射组MPF活性在hCG注射后26.5～27.5 h一直处于较低水平，28 h后逐渐升高，29 h达到高峰，之后开始下降;Wee1 B-WT-mRNA和Wee1B-S15A-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后29.5 h达到高峰，比对照组延迟30 min; Wee1B-KD-mRNA注射组MPF活性同对照组一样，在hCG注射后29 h达到高峰;但Wee1 B-S15D-mRNA注射组MPF活性一直到hCG注射后29.5h还处于较低的活性，与对照组相比差异显著。Cdc2-Tyr15的磷酸化状态与MPF活性变化相一致。　　六、激活PKA，注射Wee1B-mRNAs对小鼠受精卵发育的影响　　（一）Wee1B表达水平的检测　　2 mmol/L dbcAMP的M16培养液中培养1h后，受精卵显微注射Wee1B各种mRNAs4h后，与未注射组和TE缓冲液注射组相比，Wee1B蛋白呈现高水平表达，且各种mRNAs注射组之间没有显著区别。　　（二）dbcAMP预处理后Wee1B mRNAs对受精卵卵裂率的影响　　2 mmol/L dbcAMP存在时，各组受精卵生长受到阻滞，很少见二细胞期受精卵存在。　　（三）dbcAMP处理后MPF活性变化和Cdc2-Tyr15磷酸化状态检测　　未注射组、TE缓冲液注射组与Wee1B-KD-mRNA注射组受精卵MPF活性在hCG注射后29～35 h一直处于很低水平，提示PKA激活抑制了MPF活性;Wee1 B-WT/S15A-mRNA注射组MPF活性则在hCG注射后35h才开始缓慢升高;而Wee1 B-S15D-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后29～35 h一直处于很低水平，表明G2/M期的完全阻滞。Cdc2-Tyr15的磷酸化状态与MPF活性变化相一致。　　七、抑制PKA，注射Wee1B-mRNAs对小鼠受精卵发育的影响　　(一)Wee1B表达水平的检测　　40μmol/L的H-89持续作用下，受精卵显微注射Wee1B各种mRNAs4 h后，与未注射组和TE注射组相比，Wee1B蛋白呈现高水平表达，且各种mRNAs注射组之间没有区别。　　（二）H-89预处理后Wee1B mRNAs对受精卵卵裂率的影响　　40μmol/L H-89存在时，各组受精卵生长分裂加速。Wee1 B-WT-mRNA和Wee1 B-S15A-mRNA注射组在hCG注射后28.5 h开始出现卵裂，至30h卵裂率分别为37.83％、36.68％，两组间无差别，但与对照组相比显著降低。Wee1 B-KD-mRNA注射组与对照组无差异。Wee1 B-S15D-mRNA注射组至30h很少看见2-细胞期受精卵存在。　　（三）H-89处理后MPF活性变化和Cdc2-Tyr15磷酸化状态检测　　Wee1 B-WT-mRNA、Wee1 B-S15A-mRNA注射组MPF活性均在hCG注射后28.5 h缓慢达到高峰，比对照组高峰出现时间延迟30 min; Wee1B-KD-mRNA注射组与对照组MPF活性变化趋势相一致，但Wee1 B-S15D-mRNA注射组MPF活性在hCG注射26～29 h后一直处于较低水平。Cdc2-Tyr15的磷酸化状态与MPF活性变化相一致。　　八、小鼠1-细胞期受精卵内源性Wee1B蛋白15位Ser磷酸化状态检测　　小鼠1-细胞期受精卵未加dbcAMP和H-89处理时，在G1和S期检测到清晰的Wee1 B-Ser15磷酸化条带，而G2期和M期检测到了非磷酸化的Wee1 B-Ser15条带。当2 mmol/L dbcAMP处理小鼠受精卵后，受精卵各期都能检测到清晰的Wee1B-Ser15的磷酸化条带，而非磷酸化条带主要出现在G2期和M期;当40μmol/L H-89持续作用小鼠受精卵，G1和S期检测到Wee1 B-Ser15的磷酸化条带，在G2期和M期检测到Wee1 B-Ser15的非磷酸化条带。说明Wee1 B-Ser15在G1和S期被磷酸化，在G2和M期去磷酸化。　　讨论:　　Wee1激酶在细胞核中通过磷酸化15位Tyr来抑制Cdc2激酶的活性，进而抑制G2/M期的转换过程。母源性Wee1B基因在人、小鼠、猪和恒河猴卵母细胞中的存在，仅在最近才见报道，而Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵各个时期的表达未见报道。本实验用RT-PCR和Western Blotting方法检测Wee1B在小鼠受精卵第一次有丝分裂过程中各个不同时期的mRNA和蛋白表达。结果表明，Wee1B mRNA在受精后各个时期都有表达，且各组无显著性差异。Wee1B蛋白在G1期开始表达，S期和G2期表达增加，M期蛋白表达减少。Wee1B的蛋白表达和mRNA水平在M期不一致，可能与Wee1B的翻译后修饰有关。这种变化同从爪蟾卵细胞提取物得来的研究结果相一致，而M期Wee1B蛋白表达减少可能与泛素依赖的蛋白酶体降解有关，其具体机制也是我们进一步研究的方向之一。　　由于蛋白定位与其功能密切相关，我们利用间接免疫荧光方法检测Wee1B蛋白在小鼠1-细胞期胚胎中的定位。结果提示:1-细胞期受精卵从G2向M期的转换过程中，发生了Wee1B向细胞浆的转位，到2-细胞初期，部分Wee1B蛋白又从细胞浆回到细胞核。Wee1B在受精卵细胞内不同时期的定位变化可能依赖于核定位序列（nuclear location signal，NLS）和核输出序列（nuclear export signal，NES），但Wee1B如何实现核内外穿梭平衡来调控MPF活性，进而调控小鼠受精卵有丝分裂，也是我们实验室进一步研究的方向之一。　　为进一步验证Wee1B在小鼠1-细胞期受精卵中的作用，我们使用了Wee1BshRNA来沉默Wee1B的表达。RT-PCR和Westem blotting验证了Wee1B-shRNA能够显著降低内源性Wee1B mRNA和蛋白的表达。同时与对照组Control-shRNA注射组相比，Wee1 B-shRNA还能提高受精卵的卵裂率，降低受精卵在M期时Cdc2-Tyr15的磷酸化水平，增强MPF活性，进一步证明了Wee1B通过磷酸化Cdc2-Tyr15来参与小鼠受精卵有丝分裂的调节。　　PKA广泛参与调节多种真核细胞的细胞周期进程，但关于细胞内PKA对Wee1B的磷酸化位点在细胞周期中的调节作用尚需进一步探讨。本研究利用定点突变技术构建15位Ser的失活型突变体Wee1B-S15A和模拟磷酸化突变体Wee1 B-S15D，显微注射进入小鼠S期受精卵中，进一步探讨Wee1B15位Ser磷酸化对小鼠受精卵发育的影响。结果发现在小鼠1-细胞期受精卵内过表达Wee1B-WT和Wee1 B-S15A可有效抑制受精卵有丝分裂进程，明显降低卵裂率;而过表达Wee1 B-S15D比Wee1 B-WT更能明显抑制MPF的活性，阻滞G2/M期转换，表明过表达的Wee1B能够使细胞核中的MPF失活，这对启动有丝分裂进行是一个先决条件，并且在小鼠受精卵中Wee1B的15位Ser可能是PKA的作用靶点。　　为进一步证明细胞内PKA是否通过磷酸化Wee1B的S15位点调控小鼠受精卵的发育，我们分别将受精卵放在膜渗透型的PKA激活剂dbcAMP(2 mmol/L)和PKA催化亚单位抑制剂H-89(40μmol/L)的M16培养基中培养1h后，显微注射Wee1 B-WT/KD-mRNAs和Wee1B-S15A/D-mRNAs，结果发现在2 mmol/L dbcAMP存在时，细胞内PKA活性被完全激活，各组细胞进入M期的时间明显延迟，到了35 h很难看到2-细胞期受精卵存在，小鼠受精卵过表达Wee1 B-WT和突变体Wee1B-S15A可以加剧dbcAMP诱导的小鼠受精卵卵裂阻滞。相反，在40μmol/LH-89存在时，细胞内PKA活性被完全抑制，小鼠受精卵有丝分裂进程加快，但过表达Wee1B-WT和过表达突变体Wee1 B-S15A的作用一样，延缓受精卵有丝分裂进程，逆转由H-89引起的促进分裂作用。与此同时，本研究还发现无论M16培养液中是否有dbcAMP和H-89的存在，小鼠受精卵内过表达模拟磷酸化突变体Wee1B-S15D都不能加速有丝分裂进程，卵裂率明显受到抑制。上述实验结果说明了Wee1B蛋白S15位点是PKA在体内调控Wee1B的重要靶点。当PKA激活时，Wee1B蛋白的S15位点磷酸化，Wee1B活性增强，受精卵分裂发生阻滞;当PKA抑制时，Wee1B蛋白的S15位点的磷酸化状态受抑制进而失活，受精卵分裂加速，但过表达突变体Wee1B-S15A和Wee1 B-S15D不受PKA的调控，因而可以有效逆转H-89加速的G2/M期转换，使受精卵的分裂延迟。本研究进一步提示Wee1B蛋白的S15位点可能是PKA作用的生理靶点。　　对卵母细胞的研究表明，Wee1B蛋白在细胞核中通过磷酸化Tyr15来抑制Cdc2激酶的活性，在减数分裂停滞过程中发挥着重要的作用。本研究在此基础上进一步阐明Wee1B-S15位点Ser磷酸化对MPF活性及Cdc2-Tyr15磷酸化状态的影响。结果表明，无dbcAMP和H-89存在时，小鼠受精卵过表达Wee1 B-WT-mRNA和Wee1 B-S15A-mRNA注射组MPF活性在hCG注射后29.5 h达到高峰，比对照组延迟30 min: Wee1B-KD-mRNA注射组MPF活性同对照组到达高峰时间相同;但Wee1B-S15D-mRNA注射组MPF活性一直到hCG注射后29.5 h还处于较低的活性。在有2 mmol/LdbcAMP存在的情况下，对照组MPF活性在hCG注射后35h内一直处于很低水平，提示PKA激活后抑制了MPF活性，但过表达Wee1B-WT、Wee1B-S15A/D-mRNA的受精卵MPF活性一直处于很低水平，表明G2/M期的完全阻滞。在有40μmol/LH-89存在时，对照组MPF活性与不加H-89对照组相比提前1h达到高峰，而过表达Wee1B-WT-mRNA、Wee1 B-S15A-mRNA注射组MPF活性比对照组高峰出现时间延迟30 min，但Wee1 B-S15D-mRNA注射组MPF活性在hCG注射26-29 h后一直处于较低水平，说明内源性PKA被抑制后，可提前激活MPF活性。但过表达Wee1 B-WT和过表达突变体Wee1B-S15A和Wee1 B-S15D不受PKA的调控，因而可以有效逆转H-89加速的G2/M期转换，使MPF的活性受到抑制。与此同时，我们还观察到上述各组MPF活性的变化与其催化亚基Cdc2-Tyr15的磷酸化状态完全一致，说明Wee1B对MPF活性的影响是通过调节Cdc2-Tyr15磷酸化状态实现的。　　为进一步证明内源性Wee1B蛋白S15位点的磷酸化状态与调控细胞有丝分裂进程有关，本研究应用定制的Wee1B-pS15位的磷酸化抗体和非磷酸化抗体检测各时期Wee1B-S15位的磷酸化和非磷酸化状态。同时，为了验证PKA是否通过磷酸化Wee1B的S15位点调控小鼠受精卵的发育，在PKA的激活剂dbAMP和抑制剂H-89持续存在的条件下，也分别检测上述的磷酸化状态。结果表明Wee1 B-Ser15在G1和S期被磷酸化，在G2和M期去磷酸化，并且经dbAMP处理后的各时期细胞都处于磷酸化状态，H-89处理后的各时期受精卵的磷酸化状态与未处理组相同。上述实验结果充分说明Wee1B蛋白S15位点是PKA调控Wee1B的重要磷酸化靶点。　　总之，本研究首次验证Wee1B在小鼠受精卵1-细胞有丝分裂过程中各个细胞时期中的表达，进一步阐明PKA对小鼠Wee1B蛋白S15位点的磷酸化修饰是调控受精卵有丝分裂的重要方式。但关于S15位点磷酸化后如何影响Wee1B的活性和细胞内定位以及磷酸化的Wee1B如何脱去磷酸而失活还有待于进一步深入研究。本研究不仅为揭示小鼠受精卵早期发育机制奠定了基础，而且为阐明其它哺乳动物细胞PKA/Wee1B通路调节细胞有丝分裂的具体机制提供了新的线索和有价值的实验依据。　　结论:　　1、Wee1B蛋白的含量随着小鼠1-细胞期受精卵细胞周期的进程而变化，在M期下降。在1-细胞期受精卵不同时期，Wee1B蛋白存在核浆转位，Wee1B的定位变化可能调控小鼠受精卵有丝分裂。　　2、Wee1B表达沉默可以提前激活MPF活性，进而促进小鼠受精卵G2/M期转换，提高小鼠1-细胞期受精卵的卵裂率，更进一步说明Wee1B负调控小鼠受精卵有丝分裂的进程。　　3、PKA/Wee1B通路对小鼠受精卵早期发育具有重要的调控作用。在小鼠1-细胞期受精卵中，Wee1B可能为PKA作用的直接底物，通过对Wee1B蛋白S15位点进行磷酸化修饰抑制MPF活性，引起受精卵分裂阻滞，进而抑制G2/M期的转换。