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Toll样受体(Toll-likereceptors,TLR)为Ⅰ型跨膜蛋白,其识别病原相关分子模式后,通过依赖MyD88(Myeloiddifferentiationfactor88,MyD88)或TRIF(TIRdomain-containingadaptor-inducinginterferon-β,TRIF)信号传导通路,诱导转录因子NF-κB和干扰素调节因子的表达,启动固有免疫和适应性免疫而抵御病原入侵。在鱼类中至少发现了17种类型的TLR,其分子结构和功能有一些不同于哺乳动物的特征。斜带石斑鱼(Epinepheluscoioides)是我国南方沿海地区一个重要的养殖品种,其高密度养殖导致各种病害频频发生,给斜带石斑鱼养殖业造成严重的经济损失。为了解斜带石斑鱼的免疫系统,本研究运用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了斜带石斑鱼TLR1(EcTLR1)、EcTLR2和EcMyD88基因全长cDNA,应用生物信息学方法解析了这些基因的结构与功能,通过实时定量PCR的方法分析其在正常鱼体组织中的表达模式,以及PolyⅠ:C、细菌LPS和溶藻弧菌刺激后的应答规律。
EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88cDNA全长分别为3195bp、3439bp和1795bp;预测其开放阅读框分别为2406bp、2466bp和870bp,分别编码801、821和289个aa;其5UTR分别为240bp、378bp和243bp,3UTR分别为549bp、595bp和682bp。3UTR均有多聚腺苷酸加尾信号序列AATAAA。EcMyD883UTR存在两个mRNA不稳定基序ATTTA。
为预测功能结构域,应用SMART程序分析蛋白结构。结果显示,EcTLR1和EcTLR2蛋白胞外区分别存在9个和10个富含亮氨酸的重复基序,胞内区各有唯一的1个TIR结构域;EcMyD88蛋白的N端和C端分别存在死亡结构域和TIR结构域。潜在功能位点预测TLR1蛋白拥有N糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N酰基化位点和酪氨酸激酶磷酸化位点5种功能基序。TLR2蛋白除有N糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N酰基化位点外,还有依赖cAMP和cGMP蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、细胞附着序列和亮氨酸拉链结构。EcMyD88只有酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点功能基序。
序列比对分析显示EcTLR1氨基酸序列与其它鱼类的TLR1同一性为47.5-62.4％,与哺乳动物和禽类TLR1的同一性分别为36-38.2％和36.2-37.1％。EcTLR2氨基酸序列与其它鱼类的TLR2同一性为46.3-74.8％,高于与哺乳动物TLR2的同一性(39.7-40.7％)和禽类TLR2的同一性(39.1-40.1％)。EcMyD88氨基酸序列与其它鱼类的同一性高(67-78.7％),与哺乳动物和鸡的MyD88同一性较低,分别为60.9-62.6％和57.1％。EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88的TIR结构域与其它脊椎动物的同一性为56.8％-89.8％。根据TLR1、TLR2或MyD88氨基酸序列构建的3个遗传进化树,结果类似,进化树上的物种被分为鱼类、禽类和哺乳动物3支。EcTLR1、EcTLR2或EcMyD88同一性和进化树分析显示斜带石斑鱼与其它鱼类的遗传关系亲近。
在所有组织中均检测到EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88mRNA。EcTLR1和EcTLR2主要在脾脏、头肾和胸腺中表达,EcMyD88主要在肝脏、脾脏、头肾和胸腺中表达。注射斜带石斑鱼LPS24h后,脾脏和胸腺中的EcTLR1、EcTLR2、EcMyD88和EcIL-1βmRNA水平上调1.52-2.47倍。注射PolyⅠ:C24h后,头肾、脾脏和胸腺中的EcTLR1、EcTLR2、EcMyD88和EcIL-1βmRNA水平上调1.52-3.64倍。腹腔注射溶藻弧菌后3-7d头肾中的EcTLR1和EcTLR2mRNA转录上调1.59-2.57倍;脾脏中的EcTLR1和TLR2mRNA在感染溶藻弧菌后1d上升1.47和1.9倍;头肾和脾脏中的EcMyD88和EcIL-1β的mRNA在感染溶藻弧菌后1-7d均上升2-39.75倍。表明EcTLR1、EcTLR2和EcMyD88参与了溶藻弧菌感染的免疫应答。
为制备抗EcMyD88的多克隆抗体,将EcMyD88编码区克隆至pET-32a,构建了原核表达载体pET32a-EcMyD88,将其转化大肠杆菌BL21,在IPTG诱导下表达了EcMyD88。应用His-Bind树脂柱成功纯化EcMyD88重组蛋白,利用纯化蛋白制备抗EcMyD88的多克隆抗体正在进行。