刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是一种可寄生于多种宿主、引起人兽共患弓形虫病的专性细胞内寄生性原虫。该病呈世界范围流行,全球约1/3的人受到感染,严重危害人类健康。因此,从功能基因组学和遗传学角度研究弓形虫病的发生、致病、进化和流行对弓形虫病的防制至关重要。　　 本研究的第一部分选择弓形虫强弱毒株速殖子为研究对象,应用抑制消减杂交技术,构建了感染小鼠72小时后的弓形虫国际标准强毒株RH和国内绵羊分离株(基因型Ⅱ)QHO速殖子差异表达文库。消减效率试验表明同源基因经过消减杂交后得到了有效扣除,消减效率高。通过重组质粒的克隆转化,菌液PCR鉴定插入片段,得到插入片段大小范围在200bp-1000bp。小量测序及序列分析进一步验证了所获得消减cDNA文库具有良好的特异性。　　 各从两文库挑取768个经菌落PCR鉴定为插入阳性的克隆,进行斑点杂交试验,再次验证消减文库的特异性。从两文库中一共挑选了284个斑点杂交信号比值差异值大于2或小于0.5的斑点对应的克隆,进行测序和生物信息学分析。两文库共获得99个独立基因,包括36个contigs和63个singletons。其中从RH株差减文库中获得54个弓形虫独立基因;从QHO差减文库中获得8个弓形虫独立基因,37个小鼠独立基因。　　 生物信息学分析发现,RH株的上调表达基因功能集中表现在以下几方面:(1)入侵相关蛋白,如MIC2相关蛋白、微线体蛋白和致密颗粒蛋白前体(GRA2、GRA5和GRA7)等;(2)核糖体亚基蛋白,如40S核糖体蛋白S26、S8、S24、S27、S17、S5和S3A;60S核糖体蛋白L29、P2、L10A等参与基因的表达调控;(3)参与氧化还原过程及新陈代谢反应相关酶,如乙酰辅酶A合成酶、三磷酸甘油醛脱氢酶、过氧化物酶等;(4)与细胞分化调控和信号转导相关蛋白,如丝/苏氨酸蛋白磷酸酶和二磷酸核苷激酶等。QHO株上调表达的已知功能基因主要为:(1)与基因表达调控有关,如50s核糖体蛋白L4;(2)入侵和维持弓形虫在宿主细胞内稳定感染相关蛋白,如GRA8、SRS1和亲环素蛋白;(3)分子伴侣家族,如10kDa分子伴侣。来自QHO株差减文库的小鼠基因主要参与了:(1)细胞生物学进程,如铁蛋白的重链和轻链、组织蛋白酶S、高尔基体重装配蛋白2;(2)生物学调控,如核糖体蛋白L41、SA、L18;RNA结合结构域蛋白3和5,核糖核蛋白C;(3)新陈代谢进程,如过氧化物酶、金属硫蛋白1、醛缩酶A;(4)免疫反应和应答相关蛋白,如IL-1β及受体基因、H-2主要组织相容复合物抗原Q7α链基因和淋巴细胞抗原6复合物等;(5)细胞信号转导,如蛋白酪氨酸激酶、含缬酪肽蛋白、蛋白磷酸酶和偶联特异性磷酸酶Ⅰ等;(6)与细胞结构相关,如波形蛋白和肌动蛋白相关复合物等方面。　　 本研究的第二部分对来自中国不同地域、不同宿主来源的17个弓形虫分离株、1个分离株的紫外线致弱株和来自河南和湖北省的16份被检测为弓形虫感染阳性的猪肺门淋巴结组织DNA进行了多位点PCR-RFLP分析,与标准样品Ⅰ型虫株GT1,Ⅱ型虫株PTG,Ⅲ型虫株CTG,及三种“非典型”型虫株TgCgCal、TgCatBr5和MAS进行了对比。14个样品表现为基因Ⅰ型,1株为基因Ⅱ型,18株在本研究中被定义为独特型1,剩下1株在在本研究中被定义为独特型2。结合以前的报道和本研究的结果,目前在中国共检测出5种流行的基因型。在我国不同地区的猪群中广泛流行的弓形虫有2种基因型。独特型1和基因型Ⅰ是我国主要流行的弓形虫基因型。　　 本研究的第三部分对来自世界不同地域不同宿主来源的948个弓形虫分离株进行了基因分型,并从中选取了不同的基因型虫株及部分基因型相同但宿主不同或来源地域不同的129个弓形虫虫株进行顶质体的三个蛋白基因DNA片段的扩增和测序,将测序结果拼接后,以哈氏哈蒙球虫(Hammondia hammondi)为外群,构建系统进化树。本研究再次证明了进行试验的弓形虫虫株的顶质体蛋白DNA序列没有发生重组,结果支持弓形虫进化理论中的南美理论,即弓形虫起源自南美的赤道附近地区的几个祖代虫株。 　　 本研究的第四部分对不同基因型样品的4个内含子的DNA序列进行了测序分析,发现4个内含子序列均具有多态性,UPRT-intron7和intronl的DNA序列多态性高于EF1-intron1和HP-intron2。但本研究获得的各个内含子进化树均不能反映不同基因型分离株的地域差异。　　 本研究应用抑制消减杂交技术,成功构建了弓形虫强弱毒株速殖子差异表达文库,获得了一系列强弱毒株差异表达基因的信息;采用多位点PCR-RFLP技术分析了我国流行的弓形虫虫株的遗传多样化,发现独特型1和基因型Ⅰ是我国主要流行的弓形虫基因型;测序分析了来自世界各地不同基因型虫株的顶质体和内含子的遗传变异和进化;本项研究成果为进一步研究弓形虫的毒力基因和弓形虫的起源及进化奠定了基础。