论文部分内容阅读
目的：克隆甜瓜鲨烯合酶（SQS）基因并对其序列进行生物信息学分析，构建甜瓜SQS原核表达载体，为甜瓜葫芦素类的生物合成调控研究提供新的线索和实验依据。 方法：应用异硫氰酸胍法从甜瓜叶中提取总 RNA， Oligo(dT)反转录为cDNA，作为克隆甜瓜SQS基因模板；并以3′-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase试剂盒说明书反转录，作为克隆甜瓜SQS mRNA的3′末端模板。将获得的PCR产物克隆入pGEM-T载体后并测序证实。以将获得的甜瓜SQS基因序列置NCBI上，以NCBI上的Open Reading Frame Finder分析甜瓜SQSORF，CD-Search预测结构域。ProtScale及ProtParam分析根据核苷酸序列推衍的氨基酸序列的疏水性/亲水性， NetPhos2.0 Server分析磷酸化位点，TMHMM Server v.2.0分析跨膜区。SWISS－MODEL分析三级结构。从GenBank中下载植物SQS基因，布朗葡萄藻为outgroup，以MEGA5.0软件构建了系统进化树。将甜瓜SQS基因装入pET-28a(+)载体中，酶切及测序鉴定后转化至大肠杆菌BL21（DE3），以IPTG诱导工程菌表达甜瓜SQS，提取重组融合蛋白并Ni2+亲和层析凝胶柱法进行纯化。 结果：获得甜瓜SQS基因及3′末端序列，生物信息学分析结果显示，该酶由417氨基酸残基构成，等电点为7.56。疏水性/亲水性预测结果表明，碱性氨基酸49个，酸性氨基酸49个，亲水性氨基酸159个，疏水性氨基酸100个，GRAVY值为-0.065，该蛋白为水溶性蛋白；磷酸化位点预测分析该蛋白具有丝氨酸（Ser）磷酸化位点6个，苏氨酸（Thr）磷酸化位点6个，酪氨酸(Tyr)磷酸化位点5个，其中S48处于酶活性中心相关47VSRSF52的模体中，而S196是正选择位点。其二级结构以α螺旋占为主。结构域预测结果表明，SQS属于异戊二烯合酶家族。三级结构预测提示，甜瓜SQS为单体酶，其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。以甜瓜SQS基因开放阅读框架序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。双酶切后凝胶电泳及测序表明构建原核表达载体成功。将甜瓜pET-28a(+)-SQS载体转化至大肠杆菌BL21（DE3），IPTG诱导， Ni2+亲和层析凝胶柱法分离纯化后，SDS-PAGE电泳，在约47kD处出现了目的蛋白条带。 结论：首次分离并报道了甜瓜SQS基因序列并构建了原核表达载体，生物信息学分析表明甜瓜SQS的S48和S196磷酸化位点与酶活性调节相关，为下一步研究甜瓜SQS的结构与功能，促进葫芦素类的生物合成调控研究奠定基础。