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目的:以中医“痰瘀理论”为指导,探讨炎症中痰瘀与淋巴功能的相关性,探讨痰瘀和细胞粘附,细胞外基质和胞内信号传导之间联系,深化了痰瘀理论在筋骨病中的研究。
方法:1、设计并应用ICG-NIR体内淋巴成像技术,检测在1月龄K/BxN急性关节炎小鼠与同窝对照无关节炎小鼠下肢淋巴图像,当3月龄关节炎转入慢性期后,再次检测下肢淋巴图像并应用Quicktime和Image J等相关软件进行图像数据分析;通过细胞免疫荧光法观察1月龄和3月龄K/BxN小鼠胭窝淋巴结内淋巴管和血管的增生,形态和分布;选用TNFtg小鼠作为慢性关节炎的模式动物,采用核磁共振成像技术检测VEGFR-3中和抗体治疗前与治疗8周后踝和膝关节滑膜炎性组织量和胭窝淋巴节的体积和容积,ICG-NIR体内成像采检测淋巴功能。2、软骨细胞培养,鉴定。比较分析抗Fas抗体、生长因子、FAK-RAS-MAPK和PI3K和MAPK/ERK特异性阻断剂和复方芪麝片药理血清对软骨细胞功能和相关信号通路的影响,Realtime-PCR检测FAK、Integrin、Collagen2α1、MMP-13mRNA表达的影响,Western blot检测FAK、AKT和ERK1/2激酶磷酸化。
结果:1、ICG-NIR技术是有效的观察ICG在淋巴管里的流动并可定量测量的方法,可时时定量测量淋巴流动和清除能力,反映在淋巴管的频率、强度和清除率;关节炎急性期,可见扩张的淋巴管和增快淋巴的搏动,同时ICG快速出现在胭窝淋巴结;慢性炎症期靠近足部形成许多新的淋巴管,然而ICG出现在淋巴管的过程是延后的;从1月龄到3月龄关节炎K/BxN小鼠的胭窝淋巴结的体积和淋巴窦的面积逐渐增加;VEGFR3中和抗体明显地减少了关节与胭窝淋巴结的淋巴管生成和炎症关节到胭窝的淋巴流量,明显地增加了炎症踝关节滑膜数量和体积,加重了关节炎症表现。2、诱导凋亡的软骨细胞Fak、Integrinβ1、Collagen2α1mRNA表达降低,MMP13表达增高;生长因子能部分逆转诱导凋亡后这种改变,上调Fak、Integrinβ1、Collagen2α1mRNA表达,抑制MMP13表达;加入FAK-RAS-MAPK阻断剂Herbimycin、Manumycin加重软骨细胞功能的损害;复方芪麝片含药血清增加FAK、Integrin、Collagen2α1 mRNA表达,联合生长因子IGF-1,PDGF进一步提高各基因表达,但与复方芪麝片药理血清组比较没有显著性差异。复方芪麝片含药血清可显著激活ERK1/2激酶磷酸化,对FAK,AKT磷酸化也有一定促进作用。
结论:以中医“痰瘀理论”为指导,我们利用炎性关节炎模式动物研究了淋巴功能和炎症的相关性,初步证实了痰瘀和淋巴增生及功能之间的关系;证实研究益气化瘀通络中药通过对细胞外基质和胞内信号通路的调节,从而影响细胞功能。初步证实痰瘀和细胞粘附,细胞外基质和胞内信号传导之间有一定联系,深化了痰瘀理论的现代研究。