腺病毒介导的RNA干扰降低VEGF及其受体KDR,FLT转录抑制血管形成的研究

来源 :南京师范大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:b110701007
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血管新生对于肿瘤的生长、浸润和转移过程是十分重要的。肿瘤依靠新生血管来提供营养(包括氧气)和排泄废物,转移灶的形成和发展也依赖于新生血管的形成。临床研究显示,肿瘤诱导血管新生的能力决定了其生长和转移的能力。如能有效抑制血管生成、切断肿瘤血供,有望达到抑制肿瘤生长、发展和转移的目的。 绝大多数恶性肿瘤中,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)及血管内皮生长因子受体(VEGFR)均呈高表达,形成旁/自分泌作用方式,促进内皮细胞分裂、增殖,诱导血管新生,并直接作用于肿瘤细胞刺激其生长。VEGF在一些恶性肿瘤(包括胃癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和脑癌等)中表达水平显著增高,并与肿瘤的微血管密度、恶性程度以及转移密切相关。我们因而设想下调VEGF和VEGFR表达可能会抑制血管形成,进而减缓肿瘤的生长和浸润。 RNA干扰(RNAi)是最近几年发展起来的一门新兴的抑制基因表达技术。腺病毒载体因具有感染细胞种类多、感染效率高、外源基因表达水平高且既适于体外又适于体内研究等特点而被广泛用于基因治疗和临床试验中,所以本研究采用了腺病毒介导的RNAi技术来验证我们的设想。结果如下: 1.我们用细菌内同源重组的方法构建了针对VEGF,VEGFR的SiRNA表达重组腺病毒AdH1-siRNA/VEGF,AdH1-siRNA/KDR,AdH1-siRNA/FLT,Real-time RT-CR实验表明,AdH1-siRNA/VEGF,AdH1-siRNA/KDR,AdH1-siRNA/FLT可特异性地使血管内皮细胞(HUVEC)中的VEGF,KDR,FLTmRNA量下降。其中,与对照组相比,AdH1-siRNA/VEGF干扰后,VEGF的mRNA量下降为50%,而AdH1-siRNA/KDR干扰后,KDR的mRNA量下降为52%,AdH1-siRNA/FLT干扰后,FLT的mRNA量下降为40%。 2,三种干扰病毒AdH1-siRNA/VEGF,AdH-siRNA/KDR,AdH1-siRNA/FLT对HUVEC细胞增殖有干扰作用,以AdH1-siRNA/FLT最强。加入病毒9天后,对照组的细胞平均计数为31.5×10<4>/ μl,空载病毒干扰组为28×10<4>/μl,AdH1-siRNA/VEGF干扰组为21.5×10<4>/μl,AdH1-siRNA/KDR干扰组为21×10<4>/μl,AdH1-siRNA/FLT干扰组为16.25×10<4>/μl。 3.三种干扰病毒AdH1-siRNA/VEGF,Adn1-siRNA/KDR,AdH1-siRNA/FLT对HUVEC细胞在Matrigel上形成微血管均有干扰作用,对照组每HPF形成微血管数量为10.75条,空载病毒干扰组为10.25条,实验组以AdHl-siRNA/VEGF干扰作用最弱,每HPF形成微血管数量为7条,AdH1-siRNA/KDR次之,每HPF形成微血管数量为6条,其中以AdH1-siRNA/FLT作用最强,每HPF形成微血管数量为1-2条,视野中大部分细胞均不能形成微血管,而形成大面积空斑。
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