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鸭病毒性肝炎(Duck Viral Hepatitis,DVH)是由鸭肝炎病毒(Duck HepatitisVirus,DHV)引起的4周龄以内雏鸭的高度致死性传染病。鸭肝炎病毒共有3个血清型,我国发生的鸭病毒性肝炎主要由Ⅰ型鸭肝炎病毒引起。目前主要采取弱毒疫苗注射、饮水消毒等方式防治该病。Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组P1区编码病毒特异性结构蛋白VP0(VP2和VP4.前体)、VP3和VP1。其中,VP1基因位于2103-2816位,该基因由714个核苷酸组成,编码238个氨基酸。Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组中VP1基因编码的VPl蛋白大部分暴露在病毒表面,是Ⅰ型鸭肝炎病毒主要的结构蛋白,能够比较好的诱导机体产生保护性中和抗体。
鸭瘟(DuckViralEnteritis,DVE)是由鸭肠炎病毒(DuckEnteritis Virus,DEV)引起的鸭、鹅及多种禽类的急性、败血性、热性传染病。该病的主要特征是流行比较广泛,传播迅速,发病率、死亡率都很高,给养鸭业发展带来了巨大的经济损失。鸭瘟病毒属于疱疹病毒科,α-疱疹病毒亚科。鸭瘟病毒的基因组为双股线状DNA,大小约为150 kb。由于α-疱疹病毒基因组结构中存在着非常广泛的非必需区,使用分子生物学技术,将某些外源基因插入这些非必需区,已经成功构建了多种动物疱疹病毒重组载体,为病毒活载体疫苗的研究奠定了基础。
为了构建含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的重组鸭瘟病毒,本研究将已建立的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP)进行改造,即在其绿色荧光表达盒内插入Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因。将成功构建的含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的鸭瘟病毒TK基因缺失转移载体(pBlueSK-TK-EGFP-VP1)转染入已感染鸭瘟病毒GD01株的鸭胚成纤维细胞,收取转染后的细胞液为原始病毒液,将其在鸭胚成纤维细胞内盲传3代后仍能观察到绿色荧光。随即使用空斑方法纯化分离到重组鸭瘟病毒,将其命名为GD01-VP1株。将GD01-VP1株细胞毒样品经Westen-blot检测,并测定该毒株的ELD50,最后制备GD01-VP1株鸡抗阳性血清,将该阳性血清与鸭瘟病毒、Ⅰ型鸭肝炎病毒按照等量混合后作中和试验。结果表明,在相对分子质量为54 KD位置有特异条带,且GD01-VP1株与鸭瘟病毒阳性血清中和指数为1/64,GD01-VP1株阳性血清与鸭瘟病毒中和指数为1/52,与Ⅰ型鸭肝炎病毒中和指数为1/24;将GD01-VP1株接种鸡胚,并测得其ELD50为10-4.46/0.2mL。
综上所述,本研究通过拯救含有Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1基因的鸭瘟病毒GD01-VP1株,并对其生物学特性做了初步的研究,结果表明,鸭瘟病毒GD01-VP1株阳性鸡抗血清能够对抵抗鸭瘟病毒感染起到很好的保护作用,但是抵抗Ⅰ型鸭肝炎病毒感染的能力不强,说明该病毒不足以刺激机体产生抗Ⅰ型鸭肝炎病毒的抗体。本实验通过对鸭瘟病毒GD01-VP1株的生物学特性的初步研究,为鸭瘟-鸭病毒性肝炎二联苗的研究奠定了基础。