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2010年在华东地区各地的蛋鸭场暴发了一种新的传染病-鸭坦布苏病毒病，并逐渐蔓延至全国各地的禽养殖场。临床上表现为：蛋鸭精神沉郁、厌食，并出现产蛋量急剧下降甚至停止产蛋，剖检可见卵泡出血，变性，坏死等症状；肉鸭则出现生长迟缓。该病的发病率可高达100％，死亡率则较低。经研究表明，病原为鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)。 DTMUV呈球形、有囊膜，表面有纤突，直径通常为45-50nm。基因组为具有感染性的单股正链RNA，大小为10.9 kb，由5’端和3’端非编码区(UTR)及一个开放阅读框(ORF)组成，基因组的顺序为5’-UTR-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR-3’。其中，DTMUV的非结构蛋白NS1是黄病毒中最大的，能编码404个氨基酸。NS1蛋白在黄病毒属病毒复制和致病过程中发挥的重要作用，如黄病毒属中乙型脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus，JEV)和西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)的NS1蛋白均参与病毒的RNA复制，能诱发机体在非中和性抗体存在的情况下产生保护性免疫，因此同属黄病毒属的鸭坦布苏病毒的NS1也很可能有此作用。NS1蛋白可以作为包被抗原，用于检测机体免疫水平的ELISA方法的建立。鉴于大多数黄病毒是人畜共患的病原，因此，该病毒具有十分重要的公共卫生学意义。 本研究参考GenBank已登陆的鸭坦布苏病毒(Duck Tembusu Virus，DTMUV)NS1基因序列(GenBank JF312912)，设计一对特异性引物，用RT-PCR方法扩增得到NS1基因片段，并克隆至pMD-18T Simpie载体，经菌液PCR扩增、双酶切及基因测序鉴定正确。然后，构建了pET32a-NS1重组表达载体，转化至DH5α，经菌液PCR扩增，双酶切鉴定，成功构建了重组质粒。将该质粒转化大肠杆菌Rosetta宿主菌株，经1.0 mM IPTG诱导3 h获得初步表达的NS1融合蛋白，该蛋白相对分子质量为59kDa。经Western Blot分析表明，该重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应，表明其具有良好的反应原性。通过优化IPTG诱导的时间和浓度，筛选出蛋白最佳表达条件，并在此条件下(表达量最大时的最佳诱导时间与IPTG诱导浓度，然后扩大培养)大量诱导蛋白表达，经Ni-NTA His·Bind树脂纯化，测得纯化后的蛋白浓度为0.600mg/mL。 将纯化的DTMUV NS1蛋白作为包被抗原，以采自本实验室用DTMUV分离株攻击DTMUV阴性鸭耐过后28天的血清作为一抗，利用方阵法建立进行ELISA试验，确定了该方法的抗原最适包被浓度为1.875μg，血清的最佳稀释度为1:200，酶标二抗最佳浓度为1:16000，酶标二抗最佳作用时间为45min。在此优化条件下，阴阳性临界值判定标准为0.467。用建立的间接ELISA方法对番鸭细小病毒(Muscovy duckparvovirus，MPV)、鹅细小病毒(Goose parvovirus，GPV)、鸭肝炎病毒(Duck HepatitisVirus，DHV)、鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)阳性血清进行了检测，均无交叉反应，表明该方法具有良好的特异性。批内和批间重复试验的最大变异系数分别为6％和10％，显示该方法具有很好的稳定性。用建立的ELISA方法检测接种过DTMUV疫苗并经攻毒后恢复产蛋率的蛋鸭70份临床血清样品，测得52份为阳性，18份为阴性，阳性率为74.3％，对未接种过DTMUV疫苗的40份蛋鸭血清样品进行检测，38份为阴性，阴性率为95％。 本实验成功地构建了原核表达载体pET32-NS1，并成功诱导了DTMUV NS1蛋白的原核表达，该重组蛋白能与DTMUV阳性血清发生特异性反应，表明其具有良好的反应原性。目前尚未见到关于利用NS1基因表达蛋白对DTMUV抗体建立间接ELISA检测方法的文献报道，本研究为研制DTMUV病的诊断和流行病学监测方法奠定了基础。