研究背景和目的:世界卫生组织(WHO)最新数据显示,2012年,全球有约740万人死于缺血性心脏病(ischemia heart disease,IHD),占总死亡人数的13.2%,高居全部死亡病因之首。人类在出生后不久心肌就丧失了有效的再生能力,急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)发生后,坏死的心肌细胞发生不可逆死亡,由瘢痕组织(scar tissue)所取代,在心室腔的持续负荷下,发生心室重构(ventricular remodeling)并最终发展为心力衰竭(heart failure,HF)。经皮冠状动脉介入术(PCI)、冠状动脉旁路移植术(CABG)及药物溶栓等手段的应用大大地降低了AMI的早期死亡率,但HF发生率及远期死亡率仍居高不下。因此,临床亟待建立一种促进心肌再生、抑制心室重构的治疗手段。研究显示,干细胞治疗可以促进心肌再生,改善心功能。但局部缺氧环境和炎症反应等因素,使移植干细胞的存活率极低,因而限制了其临床应用。所以,提高干细胞存活率是干细胞治疗的关键。基于组织工程技术的心肌补片(cardiac patch)模拟细胞外基质(ECM),为移植干细胞的存活和增殖提供优化的微环境(microenvironment),可提高干细胞的存活率。此外,有研究证实,用聚丙烯网片(marlex mesh)限制AMI后的心脏扩大,可抑制左室重构,改善心功能,并延缓HF的发生。因此,作为干细胞载体并为心室提供机械支撑的心肌补片有可能成为干细胞治疗的理想模式。心肌补片是干细胞渗透、趋化、定植和增殖分化的载体和支架,同时也为心室提供适当的机械支撑而限制心室的扩张,因此,材料的选择和设计极为关键。纤维素是自然界含量极为丰富的天然高分子多糖,有很好的生物相容性,也具有一定的机械强度,可为心室提供稳定的机械支撑,通过静电纺丝技术将其制备成纳米纤维膜,具有互相贯通的三维结构,利于营养物质的输送和细胞间的信号传导,从微观结构上看,是作为组织工程补片的理想材料。然而,纤维素结构稳定,亲水性欠佳。层层自组装技术(LBL)利用正负电荷的相互作用而形成多层自组装体系,能有效地构建生物活性表面,用生物相容性更好的丝素蛋白(SF)和壳聚糖(CS),利用LBL技术使其在纤维素纳米纤维表面形成多层生物活性膜,可大大地提高其生物相容性。脂肪间充质干细胞(AD-MSCs)大量存在于脂肪组织,取材方便,体外培养活性好,无伦理学问题,免疫原性低,旁分泌作用和分化能力强,且不产生畸胎瘤,是组织再生理想的种子细胞,具有良好的临床应用前景。因此,本课题拟利用静电纺丝技术和LBL技术,制备CS/SF改性的纳米纤维膜作为心肌补片,用稳定表达萤火虫荧光素酶(Fluc)和绿色荧光蛋白(GFP)的AD-MSCs作为种子细胞,将两者进行三维共培养后用于AMI的心肌组织工程修复,并探讨其对AMI后的心肌修复作用及其作用机制,为进一步临床研究提供理论依据。研究方法:1.醋酸纤维素(CA,Mn=3×104 Da)在16 k V的直流电压下静电纺丝16 h制备醋酸纤维素纳米纤维膜,在0.05 mol/L氢氧化钠溶液中水解7 d得到纤维素纳米纤维膜。通过LBL技术使带正电荷的CS和带负电荷的SF在纤维素纳米纤维表面形成多层膜结构。电位测定仪测定CA、CS和SF的ζ-电位,X射线光电子能谱(XPS)确定纳米纤维膜构建成功,扫描电子显微镜(SEM)观察纳米纤维膜的微观结构。2.无菌条件下取小鼠精囊腺及肾周脂肪组织,用酶消化法分离培养AD-MSCs,显微镜观察细胞形态,生物发光成像(BLI)确定Fluc的活性与细胞数量的相关性,流式细胞术鉴定AD-MSCs特征性标志物。3.取第2~5代对数生长期AD-MSCs与不同(CS-SF)层数的纳米纤维膜进行共培养,评估其生物相容性,以选择合适的(CS-SF)的LBL层数。共培养后,激光共聚焦显微镜(CFM)观察细胞生长形态,扫描电子显微镜(SEM)观察细胞超微结构,MTT比色法评估细胞的增殖活性。4.将SD大鼠随机分为四组,分别为:1.急性心肌梗死组(MI),在大鼠左心耳下缘3㎜处结扎冠状动脉前降支,建立AMI模型;2.假手术组(Sham),缝线前降支下穿过但不结扎;3.心肌梗死+心肌补片组(MI+Patch),建立AMI模型的同时给予心肌补片治疗;4.心肌梗死+心肌补片+AD-MSCs组(MI+Patch/AD-MSCs),建立AMI模型的同时给予种植有AD-MSCs的心肌补片治疗。24h后,取大鼠心脏进行伊文氏蓝-TTC染色,比较各组大鼠的心梗面积大小。5.术后24h,TUNEL染色测定各组心肌细胞凋亡。术后3d、7d、14d、28d,用小动物超声进行心功能监测,BLI对移植AD-MSCs进行在体示踪。28d后,马松染色确定心肌瘢痕面积和纤维化程度,内皮细胞标记物CD31免疫组化染色检测梗死周围区的血管新生。研究结果:1.通过静电纺丝技术和LBL技术,成功制备CS/SF纳米纤维膜。CA、CS、SF的ζ-电位在p H为6.04、6.44和6.84条件下,分别为﹣21.3、﹢25.4和﹣10.2(m V),提示CS、SF可通过电荷作用自组装到纤维素纳米纤维表面。XPS测定的结果提示CS/SF纳米纤维膜构建成功。纳米纤维在SEM下直径均一,具有良好的三维多孔结构。2.成功分离培养稳定表达Fluc和GFP的AD-MSCs,普通光镜下,细胞呈梭形贴壁生长,胞浆透明、清亮,荧光显微镜下可见GFP分布均匀,绿色荧光信号强。Fluc的信号强度随细胞数量的增加而增加,定量分析显示信号强度与细胞数量呈线性相关。流式细胞术显示本实验分离培养的AD-MSCs胞膜CD44、CD90呈双阳性表达,CD34、CD45呈双阴性表达,为AD-MSCs的特征性标记物。3.SEM可见AD-MSCs在10.5层(CS-SF)的纳米纤维膜上增殖活跃,生长形态和状态良好。CFM及MTT比色法的结果提示AD-MSCs与10.5层(CS-SF)的纳米纤维膜共培养后呈三维分布,增殖状态好。通过对不同(CS-SF)层数的纳米纤维膜的生物相容性进行对比,发现10.5层(CS-SF)的纳米纤维膜生物相容性最好,故在动物实验中选择10.5层(CS-SF)的纳米纤维膜用于心肌补片。4.结扎大鼠冠状动脉前降支后,结扎线以下心肌苍白,心电监护显示ST-T段抬高。补片通过自身黏附作用牢固地黏附在心外膜表面,4w后已与心外膜融合。伊文氏蓝-TTC染色显示AMI模型构建成功且各组的心梗面积大小无差别。5.TUNEL染色显示MI+Patch/AD-MSCs组心肌细胞凋亡最为明显。超声心动图结果表明,MI+Patch/AD-MSCs组心脏收缩功能和心室重构的改善作用更为显著。BLI结果表明,移植的AD-MSCs在术后4w仍有相当部分的存活。马松染色提示,MI+Patch/AD-MSCs组的心肌瘢痕面积和纤维化程度最小。CD31免疫组化证实,MI+Patch/AD-MSCs组的血管新生的密度最大。研究结论:1.静电丝纺技术可将纤维素制备成互相贯通的多孔三维结构。层层自组装技术(LBL)利用正负电荷的相互作用构建生物活性表面。使带正电且具有抑菌和黏附作用的壳聚糖(CS)和带负电具有弹性和缓释作用的丝素蛋白(SF)通过正负电荷的相互作用,在纤维素纳米纤维膜表面构建多层生物活性结构,得到改性的CS/SF纳米纤维膜,通过与AD-MSCs的共培养发现,LBL技术可增加纤维素纳米纤维的生物相容性,其中,LBL 10.5层(CS-SF)的纳米纤维膜生物相容性最好,故将其用作心肌补片。2.将CS/SF纳米纤维膜作为AD-MSCs载体进行AMI干细胞移植治疗,有利于AD-MSCs存活,提高干细胞的治疗效率。3.单纯心肌补片即具有改善心梗后心功能,减小瘢痕面积,抑制细胞凋亡、促进血管新生的作用,同时作为AD-MSCs的载体,与AD-MSCs在抑制心室重构、促进心肌修复方面具有协同作用。