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猪轮状病毒(Porcine rotavirus,PRV)是无囊膜、分节段的双股RNA病毒,隶属于呼肠孤病毒科,是引起幼年仔猪发生腹泻的主要病原之一。猪轮状病毒感染世界各地分布广泛,给养猪业造成严重的经济损火,故研究一种有效地抑制病毒感染的方法尤为重要。VP4蛋白是轮状病毒粒子中最重要的结构蛋白之一,是一种中和抗原,能够刺激动物机体产生抗病毒中和抗体,激发免疫保护,在PRV的诊断及预防中具有非常重要的作用。本实验根据GenBank所收录的PRV JL94株VP4基因碱基序列,设计一对特异性引物,从本实验室分离鉴定的DN30209株扩增VP4全长基因,并成功构建重组质粒VP4-pMD18-To重组质粒经测序和分析表明：DN30209株VP4全基因长2331bp,包含完整的开放阅读框,与参考株JL94的核苷酸同源性为99.7%,氨基酸同源性为99.5%。将VP4全长基因连接到pGEX-6P-1原核表达载体中,构建并筛选出阳性原核表达载体重组质粒,标记为pGEX-6P-1-VP4。将阳性重组质粒转化Rosetta宿主菌感受态细胞中,经IPTG诱导,获得以包涵体形式表达的重组蛋白,融合蛋白大小约为112kDa,与预期大小相符。回收、纯化并复性该蛋白,并将其作为免疫原免疫大白兔,制备兔抗PRV VP4全长蛋白多克隆抗体,并通过间接ELISA测定多抗效价达到105,间接免疫荧光(IFA)和免疫印迹(Western Blot)表明其与PRV具有很好的抗原抗体反应性。脂筏是富含胆固醇和鞘磷脂的脂质微区,胆固醇在许多病毒的感染过程中扮演重要角色,是脂质微区的重要组成成分,研究细胞膜胆固醇在PRV感染过程中的功能和相关机制有重要意义。间接免疫荧光、Western Blot和Real Time PCR三种方法检测MβCD消耗胆固醇及再补加胆固醇后,病毒感染能力的变化。结果表明MβCD通过消耗细胞膜胆固醇能有效地抑制PRV感染MA104细胞,且呈现明显的剂量依赖性。消耗细胞膜胆固醇后,再添加外源性的胆固醇,PRV的感染力得到了一定程度上的恢复。综上,本实验证明细胞膜胆固醇在PRV感染MA104细胞的过程中扮演重要角色,其对PRV的感染是必不可少的,为进一步研究病毒感染与脂筏之间的相关性奠定基础,为研究病毒的感染机制提供重要的理论依据。