肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体TRAIL(TNF-related apoptosis-inducingligand,TRAIL)是TNF超家族一个新成员。研究表明TRAIL是一个非常有前景的抗肿瘤药,可以选择性地诱导黑色素癌,淋巴癌,结肠癌,肺癌及乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞凋亡但是对大部分正常细胞的影响很小。这是目前其他类型的诱导细胞凋亡配体如TNFα、FasL、CD40等不可比拟的。TRAIL与临床上使用的多种化疗药物或放射疗法的联用具有显著的协同效应,提高抗肿瘤效果。但是,随着研究的深入,研究报道TRAIL参与胸腺细胞凋亡或负向调节并在自身免疫性疾病中扮演重要角色。大剂量的TRAIL可以诱发肝细胞的凋亡和肝炎,诱导淋巴细胞、星状角质细胞以及脑细胞凋亡。由此人们对于TRAIL抗肿瘤治疗的安全性产生了疑虑,认为其有潜在的毒性。此外TRAIL是蛋白类生物药,在体内的半衰期很短,只有几十分钟。在临床应用时,病人一个疗程需要几克以上的蛋白用量,这对TRAIL的生产、纯度、质量控制和生产成本都带来了巨大的挑战,同时也势必加重病人的医疗费用和负担,而且如此大的药物剂量也增加了副作用的可能性和程度。通过改造TRAIL改善TRAIL在肿瘤组织的分布减少体液循环中的损失有望提高TRAIL的治疗效果,缓解TRAIL的副作用。面对这一难题,我们进行两方面的研究。一方面对TRAIL进行基因工程改造,开发具有肿瘤靶向性的高效的TRAIL变体分子;一方面筛选与TRAIL联用中具有抗肿瘤协同效应的化合物。目标是希望提高TRAIL的抗肿瘤活性,减少临床使用剂量,降低成本,降低潜在的毒副作用。在设计肿瘤靶向性的TRAIL变体分子时,我们选择增强TRAIL与肿瘤新生血管的结合来实现肿瘤靶向性。恶性肿瘤的迅速增殖需要大量新生血管的增生来供应营养,因此肿瘤的新生血管非常适合作为肿瘤治疗的靶点。与正常的血管内皮细胞不同,肿瘤部位的新生血管内皮细胞因受到肿瘤微环境的影响特异性地高水平表达一些诸如integrinαvβ3/αvβ5、CD13等分子,而这些分子在静止期细胞和正常的血管内皮细胞表达甚微。此外,相当多的恶性肿瘤细胞本身也表达integrinαvβ3/αvβ5或CD13分子。文献报道,用噬菌体肽库筛选技术,发现ACDCRGDCFC和CNGRC肽分别与integrinαvβ3/αvβ5和CD13高亲和。相关报道证明这两个肽能够非常有效地将与之藕联的化疗药物或凋亡诱导剂靶向输到肿瘤部位从而增强抗肿瘤效果。　　 本研究对TRAIL(114-281氨基酸)进行了的蛋白质工程的改造,在其N端分别引入ACDCRGDCFC和CNGRC肽,分别命名为RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL分子。RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL分别在在大肠杆菌系统中高效表达,获得纯度大于95％的可溶形式的RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL蛋白。体外实验表明RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL变体蛋白既具有TRAIL的诱导肿瘤细胞凋亡的活性,又具有跟新生微血管内皮细胞结合的特性。进一步研究表明,与TRAIL相比,RGD-L-TRAIL对αvβ3/αvβ5阳性的肿瘤细胞诱导凋亡能力显著提高,NGR-L-TRAIL对CD13阳性的肿瘤细胞诱导凋亡能力显著提高。体内动物实验表明,RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL比TRAIL具有更好的抗肿瘤活性。在相同剂量下,RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL抑制肿瘤生长的效果显著优于TRAIL。在达到相同的抑制肿瘤生长程度时,RGD-L-TRAIL所需的剂量是TRAIL剂量的1/5,NGR-L-TRAIL所需的剂量低于TRAIL剂量的1/5。在与化疗药物CPT-11联合使用下,RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL疗效更加显著,效果优于各自单独给药。不仅如此,在多种肿瘤模型的联合治疗方案中发现,要达到相同的治疗效果,RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL需要的剂量均低于TRAIL的剂量。同时,通过同位素标记的方法,发现RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL在肿瘤组织分布高于TRAIL。总之,我们的结果表明了TRAIL融合ACDCRGDCFC或CNGRC肽后,能够将TRAIL靶向性输送到肿瘤区域,显著性提高抗肿瘤效果。总之,具有肿瘤靶向性的RGD-L-TRAIL和NGR-L-TRAIL变体蛋白具有非常好的应用前景。在筛选与TRAIL联用中具有抗肿瘤协同效应的化合物时,我们将目光投向了传统中药冬凌草中提取的具有抗肿瘤活性的单体oridonin。研究发现,在多种肿瘤细胞中,低毒性剂量下的oridonin能增强TRAIL诱导肿瘤细胞凋亡的效果,也就是说oridonin与TRAIL联用具有抗肿瘤协同效应。我们探讨了在TRAIL不敏感的A549肺癌细胞中,oridonin与TRAIL联用的协同效应机制。结果发现oridonin可以将细胞周期阻滞在G2/M期,上调p53、GADD45、puma和死亡受体DR5等蛋白的表达水平,下调细胞内pro-caspase8的竞争性抑制剂Flips的蛋白含量。在oridonin和TRAIL联用后,western blot检测到pro-caspase8的蛋白量减少,caspase8增多,Bid蛋白量降低,caspase3和PARP水解。同时用荧光底物法检测到caspase8和caspase9的酶活在oridonin与TRAIL联用后显著提高。研究结果提示,oridonin与TRAIL联用可以提高TRAIL的抗肿瘤效果,扩大TRAIL的应用范围,降低使用剂量。