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抗冻蛋白具有热滞活性,但生物体内的天然抗冻蛋白活性很难满足诸多方面应用。因此,探索出生产高活性抗冻蛋白的有效方法亟待解决。本研究基于此目的利用基因工程的技术和方法开展了抗冻蛋白基因的分子改造和表达工作。以黄粉甲AFP84a为材料,运用现代分子生物学技术在体外人工构造了AFP84a二体和三体的目的DNA片段。将两段目的基因与载体pMAL-p2X双酶切后连接,构建了两个分泌融合表达质粒;表达质粒转化E.coli TBI后,经IPTG诱导表达,目的蛋白表现为可溶性。MgSo<,4>溶解法与超声波细胞破碎法均能使目的蛋白从细胞中释放,MgSo<,4>的合适浓度为0.05 mmol/L。运用亲和层析和分子筛层析纯化后,SDS-PAGE显示目的蛋白呈单一条带,生物活性实验检测目的蛋白具有一定的抗冻活性。
使用生物信息学方法对目前已经研究过的抗冻蛋白进行综合分析,从GenBank中搜索不同物种中的抗冻蛋白基因进行比较分析,并构建了它们的同源进化树。此外,还运用电子克隆的手段,在黑猩猩的全基因组中找到了一个类鱼类AFPⅢ的基因,使用在线基因结构分析工具预测其外显子和内含子,并用ORF Finder预测了编码的氨基酸序列。