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目的：明确EB病毒相关胃癌(EBV-associatedgastriccarcinoma,EBVaGC)WNT5A表观遗传学异常及其生物学意义。探讨EBVaGC和EBV阴性胃癌(EBV-negativegastriccarcinoma,EBVnGC)组织中视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,Rb)和转化生长因子β1(transforminggrowthfactorβ1,TGF-β1)基因启动子甲基化状态及蛋白表达,探讨EBV感染与Rb,TGF-β1基因甲基化及蛋白表达的关系。
方法：①选取5种EBV阳性和15种EBV阴性胃癌细胞系作为研究对象,RT-PCR检测上述细胞系WNT5AmRNA的转录表达。②甲基化特异性PCR(Methylation-specificPCR,MSP)及亚硫酸氢盐基因组测序法(Bisufitegenomicsequencing,BGS)检测胃癌细胞系以及EBVaGC,EBV阴性胃癌(EBV-negativegastriccarcinoma,EBVnGC)和相应癌旁组织中WNT5A编码基因启动子区甲基化状态。③实时荧光定量PCR(RealtimequantitativePCR,realtimeqPCR)检测去甲基化药物作用前后EBV阳性细胞系和部分EBV阴性胃癌细胞系WNT5A表达。④构建重组表达质粒pcDNA3.1-WNT5A转染EBV阳性细胞系SUN719,WesternBlotting或RT-PCR检测转染后外源性WNT5A表达对β-Catentin,c-Jun和JunB蛋白以及ATF2,c-myc和EGFRmRNA转录表达的影响。⑤采用甲基化特异性PCR(methylmion-specificPCR,MSP)对各种临床病理指标匹配的30例EBVaGC和38例EBVnGC组织中Rb和TGF-β1基因启动子区域的甲基化状态进行检测。⑥免疫组化技术检测两种胃癌组织中Rb和TGF-β1蛋白的表达。⑦采用靶向LMP1的小干涉RNA和/或TGF-β1作用EBV阳性和阴性胃癌细胞系,RT-PCR方法检测LMP1相关因子MMP9,Survivin,CDK4,EGFR和ICAM-1转录表达。
结果：①RT-PCR结果显示,EBV阴性细胞系WNT5A表达较为普遍,而EBV阳性细胞系中则表达缺失或下调。②MSP检测结果发现5种EBV阳性细胞系中WNT5A编码基因启动子均表现为不同程度的甲基化,只有部分EBV阴性细胞系发生不同程度的甲基化。BGS检测结果显示,EBV阳性胃癌细胞系WNT5A编码基因启动子区49个CpG位点甲基化率显著高于EBV阴性胃癌细胞系,两者间具有显著性差异(F=305.414,P＜0.05)。③两对特异性MSP引物(WNT5Am1/m2和WNT5Au1/u2;WNT5Am3/m4和WNT5Au3/u4)检测23例EBVaGC和25例EBVnGCWNT5A启动子甲基化状态,结果显示,两组间比较差别均有统计学意义(WNT5Aml/m2∶X2=7.561,P=0.006:WNT5Am3/m4∶X2=5.298,P=0.0214)。两对特异性MSP引物检测EBVaGC和EBVnGC及其匹配的癌旁组织中甲基化状态,EBVaGC和癌旁组织比较有显著性差异(WNT5Am1/m2∶X2=18.050,P=0.000;WNT5Am3/m4∶X2=10.083,P=0.0015),而EBVnGC和癌旁组织比较差别无统计学意义(WNT5Am1/m2∶X2=3.500,P=0.061;WNT5Am3/m4:X2=2.286,P=0.131)。④qPCR检测结果显示,去甲基化药物Aza作用EBV阳性胃癌细胞系SUN719可以重新激活WNT5A,恢复其表达。⑤重组质粒pcDNA3.1-WNT5A转染EBV阳性胃癌细胞系SNU719,WesternBlotting结果显示,外源性WNT5A表达可以显著抑制WNT/β-Catenin信号通路中β-Catenin表达。⑥与质粒对照组及变异型WNT5A重组质粒组比较,转染野生型WNT5A重组质粒的SUN719细胞c-Jun和c-myc表达水平没有发生显著变化;而JunB表达明显升高,ATF2和EGFR转录表达显著降低,差别具有统计学意义(P＜0.05)。⑦EBVaGC和EBVnGC组织中Rb基因启动子甲基化检出率分别为80.0%(24/30)和50.0%(19/38),差异有显著性(X2=6.490,P=0.011);EBVaGC和EBVnGC组织中TGF-β1启动子基因甲基化检出率分别为(50.0%,15/30)和(36.8%,14/38),差异无显著性(X2=1.187,P=0.276)。⑧EBVaGC和EBVnGC组织中Rb蛋白表达率分别为43.3%(13/30)和63.2%(24/38),TGF-β1蛋白表达率分别为56.7%(17/30)和63.2%(24/38),差异均无显著性(Rb∶X2=2.656,P=0.103;TGF-β1∶X2=0.295,P=0.587)。胃癌组织中Rb和TGF-β1启动子基因甲基化与其蛋白表达无明显负相关(Rb∶X2=2.943,P=0.086,r=0.208;TGF-β1∶X2=3.051,P=0.081,r=0.212)。胃癌组织中Rb启动子基因甲基化、Rb蛋白表达缺失以及TGF-β1蛋白表达与病人年龄、性别、分化程度和肿瘤部位无相关性,但与肿瘤浸润深度和淋巴结转移相关(P均＜0.05);TGF-β1启动子基因甲基化与病人年龄、性别、分化程度和淋巴结转移无相关性,但与肿瘤浸润深度和肿瘤部位相关(P均＜0.05)。⑨与未转染组和转染脂质体组比较,siRNA-LMP1和siRNA-LMP1+TGF-β1转染EBV阳性细胞GT38,均可导致GT38细胞MMP9,Survivin和ICAM-1表达降低,而CDK4表达升高,差异均有显著性(P均＜0.05);siRNA-LMP1+TGF-β1转染组EGFR表达水平显著高于对照组(P＜0.05),而siRNA-LMP1组与对照组比较无显著性差异。⑩与对照组比较,TGF-β1作用可导致EBV阳性GT38细胞ICAM-1的表达显著降低,差异有显著性(P＜0.05),而在EBV阳性细胞系SNU719和EBV阴性细胞系(SGC7901和HGC-27)ICAM-1的表达无显著差异;TGF-β1作用对4种细胞系MMP9,Survivin,CDK4和EGFRmRNA的转录表达无明显影响。
结论:①EBV阴性细胞系中WNT5A的表达较为普遍,而在EBV阳性细胞系中则表达缺失或下调,去甲基化试剂处理可诱使EBV阳性细胞系WNT5A的重新表达,WNT5A编码基因启动子区高甲基化是EBV阳性细胞系WNT5A表达缺失或下调的重要机制。②EBVaGC组织中WNT5A编码基因启动子区呈高甲基化状态,且其甲基化状态明显高于EBVnGC,提示WNT5A参与EBVaGC的发生发展,可能是EBVaGC重要的表观遗传学标志。③外源性WNT5A的表达可诱导EBV阳性细胞系SNU719中某细胞因子,如β-Catenin、JunB、ATF2、EGFR表达水平的变化,这些变化可以抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,提示WNT5A在EBVaGC发生发展中发挥负性调节作用。④胃癌组织细胞中Rb基因异常甲基化较为常见,EBV可Rb基因甲基化,进而影响其基因表达参与EBVaGC的发生;而胃癌组织中EBV感染对TGF-β1编码基因的甲基化以及蛋白表达无明显影响。⑤Rb异常甲基化、表达缺失及TGF-β1表达检测可以作为临床判断胃癌浸润和转移的重要参考指标。⑥LMP1可调控MMP9,Survivin和CDK4表达,LMP1与TGF-β1相互作用可调控ICAM-1和EGFR的表达。